3 way Anovas
Daniela Cruz Gallo
27/4/2021
Import Data and Packages
require(readxl)
require(ggplot2)
require(plotly)
require(emmeans)
require(multcomp)
require(tidyverse)
require(ggpubr)
require(rstatix)
require(lmerTest)
require(Rmisc)
data=read_excel("C:/Users/Claudia Gallo/Desktop/Bioestadistica/dat3way.xlsx")
data$CO2=as.factor(data$CO2)
data$id=as.factor(paste(data$Cab,"_",data$Obvs,sep=""))
names(data)[4]="Genotype"Flushing
Exploratoring Data
g1=ggplot(data,aes(x=CO2,y=Flushing,fill=Temp))+geom_boxplot()+facet_grid(~Genotype)+theme_bw()
g1
En la gráfica se observan diferencias entre las temperaturas principalmente y genotipos. Sin embargo, entre los niveles de CO2 no se logran evidenciar fuertes diferencias.
3 way Anova
anova=aov(Flushing~Temp*CO2*Genotype+Error(id/Genotype),data=data)
summary(anova)##
## Error: id
## Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
## Temp 2 698.7 349.3 61.892 2.25e-11 ***
## CO2 1 0.5 0.5 0.089 0.768
## Temp:CO2 2 16.6 8.3 1.469 0.246
## Residuals 30 169.3 5.6
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## Error: id:Genotype
## Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
## Genotype 1 88.89 88.89 12.945 0.00114 **
## Temp:Genotype 2 30.53 15.26 2.223 0.12583
## CO2:Genotype 1 0.50 0.50 0.073 0.78913
## Temp:CO2:Genotype 2 36.08 18.04 2.627 0.08882 .
## Residuals 30 206.00 6.87
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1El anova confirma que efectivamente existen diferencias significativas entre los niveles de la temperatura y el genotipo anidado.
Posanova - Temp & CO2
bxp=ggboxplot(data,x="Temp",y="Flushing",title="Flushing",xlab="Temp",ylab="Flushing",color="Temp",palette="lancet",facet.by="CO2")
pwc=data%>%group_by(CO2)%>%pairwise_t_test(Flushing~Temp,paired=TRUE,p.adjust.method="bonferroni")
pwc=pwc%>%add_xy_position(x="Temp")
bxp+stat_pvalue_manual(pwc,tip.length=0,hide.ns=TRUE)+labs(subtitle=paste("Anova,","F(2)","=","61.892,","p","=","<0.00001"),caption=get_pwc_label(pwc))
Se observa en general que existen diferencias entre los niveles de temperatura indicando que a menos temperatura el Flushing disminuye. Sin embargo, es más marcada esta diferencia en el nivel 700 de CO2 a pesar de que la interacción no es significativa.
Posanova - Genotype
bxp=ggboxplot(data,x="Genotype",y="Flushing",title="Flushing",xlab="Genotype",ylab="Flushing",color="Genotype",palette="lancet")
pwc=data%>%group_by()%>%pairwise_t_test(Flushing~Genotype,paired=TRUE,p.adjust.method="bonferroni")
pwc=pwc%>%add_xy_position(x="Genotype")
bxp+stat_pvalue_manual(pwc,tip.length=0,hide.ns=TRUE)+labs(subtitle=paste("Anova,","F(2)","=","12.945,","p","=","0.00114"),caption=get_pwc_label(pwc))
Se observan diferencias significativas entre los genotipos indicando que el SCA06 presenta mayor nivel de Flushing.
Supuesto de normalidad
data%>%group_by(Temp,CO2)%>%shapiro_test(Flushing)## # A tibble: 6 x 5
## CO2 Temp variable statistic p
## <fct> <chr> <chr> <dbl> <dbl>
## 1 400 31_22 Flushing 0.903 0.175
## 2 700 31_22 Flushing 0.966 0.860
## 3 400 33.5_24.5 Flushing 0.973 0.936
## 4 700 33.5_24.5 Flushing 0.797 0.00864
## 5 400 36_27 Flushing 0.916 0.255
## 6 700 36_27 Flushing 0.903 0.171NLFlush
Exploratoring Data
g1=ggplot(data,aes(x=CO2,y=NLFlush,fill=Temp))+geom_boxplot()+facet_grid(~Genotype)+theme_bw()
g1
En la gráfica se observan diferencias entre las temperaturas principalmente y genotipos. Sin embargo, entre los niveles del CO2 no se logran evidenciar fuertes diferencias.
3 way Anova
anova=aov(NLFlush~Temp*CO2*Genotype+Error(id/Genotype),data=data)
summary(anova)##
## Error: id
## Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
## Temp 2 179.9 89.93 6.212 0.00553 **
## CO2 1 9.4 9.39 0.649 0.42699
## Temp:CO2 2 38.9 19.43 1.342 0.27654
## Residuals 30 434.3 14.48
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## Error: id:Genotype
## Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
## Genotype 1 117.56 117.56 13.529 0.000917 ***
## Temp:Genotype 2 46.86 23.43 2.697 0.083756 .
## CO2:Genotype 1 34.72 34.72 3.996 0.054734 .
## Temp:CO2:Genotype 2 20.19 10.10 1.162 0.326519
## Residuals 30 260.67 8.69
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1El anova confirma que efectivamente existen diferencias significativas entre los niveles de la temperatura y el genotipo anidado.
posanova - Temp & CO2
bxp=ggboxplot(data,x="Temp",y="NLFlush",title="NLFlush",xlab="Temp",ylab="NLFlush",color="Temp",palette="lancet",facet.by="CO2")
pwc=data%>%group_by(CO2)%>%pairwise_t_test(NLFlush~Temp,paired=TRUE,p.adjust.method="bonferroni")
pwc=pwc%>%add_xy_position(x="Temp")
bxp+stat_pvalue_manual(pwc,tip.length=0,hide.ns=TRUE)+labs(subtitle=paste("Anova,","F(2)","=","6.212,","p","=","0.00553"),caption=get_pwc_label(pwc))
Se observa en general que existen diferencias entre los niveles de temperatura indicando que a mayor temperatura el NLFlush aumenta. Sin embargo, es más marcada esta diferencia en el nivel 700 de CO2, en el otro nivel, 400, no se presentan diferencias.
posanova - Genotype
bxp=ggboxplot(data,x="Genotype",y="NLFlush",title="NLFlush",xlab="Genotype",ylab="NLFlush",color="Genotype",palette="lancet")
pwc=data%>%group_by()%>%pairwise_t_test(NLFlush~Genotype,paired=TRUE,p.adjust.method="bonferroni")
pwc=pwc%>%add_xy_position(x="Genotype")
bxp+stat_pvalue_manual(pwc,tip.length=0,hide.ns=TRUE)+labs(subtitle=paste("Anova,","F(2)","=","13.529,","p","=","0.000917"),caption=get_pwc_label(pwc))
Se observan diferencias significativas entre los genotipos indicando que el SCA06 presenta mayor nivel de NLFlush.
Supuesto de normalidad
data%>%group_by(Temp,CO2)%>%shapiro_test(NLFlush)## # A tibble: 6 x 5
## CO2 Temp variable statistic p
## <fct> <chr> <chr> <dbl> <dbl>
## 1 400 31_22 NLFlush 0.957 0.736
## 2 700 31_22 NLFlush 0.870 0.0650
## 3 400 33.5_24.5 NLFlush 0.943 0.542
## 4 700 33.5_24.5 NLFlush 0.970 0.916
## 5 400 36_27 NLFlush 0.940 0.492
## 6 700 36_27 NLFlush 0.842 0.0290SD
Exploratoring Data
g1=ggplot(data,aes(x=CO2,y=SD,fill=Temp))+geom_boxplot()+facet_grid(~Genotype)+theme_bw()
g1
En las gráficas se observan diferencias entre las temperaturas en los 3 factores: Temp, CO2 y Genotipo.
3 way Anova
anova=aov(SD~Temp*CO2*Genotype+Error(id/Genotype),data=data)
summary(anova)##
## Error: id
## Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
## Temp 2 527672 263836 44.296 1.11e-09 ***
## CO2 1 203456 203456 34.159 2.15e-06 ***
## Temp:CO2 2 8428 4214 0.707 0.501
## Residuals 30 178687 5956
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## Error: id:Genotype
## Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
## Genotype 1 1797092 1797092 184.539 2.37e-14 ***
## Temp:Genotype 2 51165 25583 2.627 0.0889 .
## CO2:Genotype 1 2768 2768 0.284 0.5979
## Temp:CO2:Genotype 2 21846 10923 1.122 0.3390
## Residuals 30 292148 9738
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1El anova confirma que efectivamente existen diferencias significativas entre los niveles de los tres factores.
#Posanova - Temp, CO2 & Genotype
bxp=ggboxplot(data,x="CO2",y="SD",title="SD",xlab="CO2",ylab="SD",color="Temp",palette="lancet",facet.by="Genotype")
pwc=data%>%group_by(CO2,Genotype)%>%pairwise_t_test(SD~Temp,paired=TRUE,p.adjust.method="bonferroni")
pwc=pwc%>%add_xy_position(x="CO2")
bxp+stat_pvalue_manual(pwc,tip.length=0,hide.ns=TRUE)+labs(subtitle=paste("Anova,","F(2)","=","44.296,","p","=","<0.00001"),caption=get_pwc_label(pwc))
Se observa en general que existen diferencias entre los niveles de temperatura indicando que la temperatura promedio 33.5 presenta los mayores niveles de SD.
posanova - Genotype
bxp=ggboxplot(data,x="Genotype",y="SD",title="SD",xlab="Genotype",ylab="SD",color="Genotype",palette="lancet")
pwc=data%>%group_by()%>%pairwise_t_test(SD~Genotype,paired=TRUE,p.adjust.method="bonferroni")
pwc=pwc%>%add_xy_position(x="Genotype")
bxp+stat_pvalue_manual(pwc,tip.length=0,hide.ns=TRUE)+labs(subtitle=paste("Anova,","F(2)","=","184.539,","p","=","<0.00001"),caption=get_pwc_label(pwc))
Supuesto de normalidad
data%>%group_by(Temp,CO2)%>%shapiro_test(SD)## # A tibble: 6 x 5
## CO2 Temp variable statistic p
## <fct> <chr> <chr> <dbl> <dbl>
## 1 400 31_22 SD 0.873 0.0710
## 2 700 31_22 SD 0.908 0.199
## 3 400 33.5_24.5 SD 0.942 0.529
## 4 700 33.5_24.5 SD 0.854 0.0416
## 5 400 36_27 SD 0.893 0.130
## 6 700 36_27 SD 0.946 0.582