Bcl9 / Bcl9l son fundamentales para la regulacion mediada por Wnt de las caracteristicas de celulas madre en el epitelio del colon y los adenocarcinomas
Victor Antonio Aguilar Gutierrez - email: antonio1994aguilar@gmail.com
Introduccion
Antecedentes
La señalizacion canonica de Wnt regula los procesos criticos durante el desarrollo embrionario y la renovacion del tejido adulto, y la activacion aberrante de esta via se asocia con el cancer colorrectal y otros canceres (Clevers, 2006). La eliminacion del ARNm de BCL9L en una linea celular de cancer de colon humano indujo un fenotipo epitelial que se asocio con la translocacion de β-catenina desde el nucleo a la membrana celular, lo que sugiere que BCL9L podria regular el cambio entre las funciones adhesiva y transcripcional de la β-catenina (Brembeck et al., 2004).
La sobreexpresion de BCL9L se ha asociado con canceres de mama (Toya et al., 2007) y colon (Adachi et al., 2004; Sakamoto et al.,2007), y recientemente se ha informado que BCL9 incrementa la transcripcion mediada por β-catenina y aumenta la proliferacion, asi como el potencial metastasico de las celulas tumorales (Mani et al., 2009).
Objetivo
Investigar el papel de las proteínas Bcl9, utilizando cepas transgenicas de ratones (Mus musculus) con alelos loxP de los ortólogos lgs murinos, Bcl9 y Bcl9l, que expresan la Cre recombinasa de forma constitutiva o inducible bajo el control del promotor de villina. Centrandose en la deleción de Bcl9 y Bcl9l dirigida selectivamente al epitelio intestinal. Por lo que en esta primera parte del estudio se comparan las diferencias del epitelio del colon sano en grupos de ratones mutantes y de tipo salvaje en busca de diferencias geneticas y morfologicas causadas por la ablacion de Bcl9 y Bcl9l.
Materiales y Métodos
Diseño Experimental
Los datos de microarrays a analizar corresponden a la primera parte del estudio realizado por Deka et al. (2010) Titulado: Bcl9/Bcl9l Are Critical for Wnt-Mediated Regulation of Stem Cell Traits in Colon Epithelium and Adenocarcinomas. Publicado en: Cancer Research DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-10-0148. Los datos de esta primera parte del estudio estan disponibles en la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) con el numero de acceso: GSE21549.
En esta parte del estudio se busca diferencias entre el epitelio del colon sano disociado con EDTA de tres grupos de ratones mutantes Bcl9/Bcl9l (vil-Cre-Bcl9-/-/Bcl9l-/-) comparandolas con tres del tipo salvaje (Wildtype) de control en las que no se ha ablacionado la expresion de las proteinas Bcl9 (B-cell CLL/lymphoma 9).
Las muestras a analizar son::
- vil-Cre-Bcl9-/-/Bcl9l-/-
- vil-Cre-Bcl9-/-/Bcl9l-/- healthy colon epithelium 1
- vil-Cre-Bcl9-/-/Bcl9l-/- healthy colon epithelium 2
- vil-Cre-Bcl9-/-/Bcl9l-/- healthy colon epithelium 3
- wildtype
- wildtype healthy colon epithelium 4
- wildtype healthy colon epithelium 5
- wildtype healthy colon epithelium 6
Flujo de trabajo
Se descargaran os datos de microarrays crudos desde GEO (Gene Expression Omnibus) en formato .cel y seran analizados utilizando el programa RStudio version 1.3.1093 y las librerias disponibles en Bioconductor (www.bioconductor.org). Para el manejo de los datos crudos se utilizara la libreria Affy (Gautier et al., 2004) y las funciones ReadAffy y cdfName; las librerias simpleaffy (Miller, 2009) y affyPLM (Bolstad, 2004; Bolstad et al., 2005) seran usadas para realizar el control de calidad, preprocesameinto de datos y estimacion de los niveles de expresion con las funciones: qc, rma, exprs, respectivamente. Se empleara limma (Ritchie, 2015) para la seleccion genes diferencialmente expresados, con las funciones model.matrix, lmFit, makeContrasts, contrasts.fit, eBayes y topTable. Annaffy (Smith, 2020) nos permitira anotar los genes expresados diferencialmente, las funciones a utilizar son aafTableAnn, saveHTML y saveText.
Posterior se realizaran Diagramas de Venn utilizando Venny (Oliveros, 2015) y el enrequecimiento de terminos de Ontologia de Genes con ayuda de las herramientas web GOrilla (Eden et al., 2009) y ReVIGO (Supek et al., 2011).
A continuacion se resumen las librerias, funciones y herramientas web a utilizar en el analisis computacional:
Flujo de trabajo.
Resultados
Análisis de la calidad
library(affy)## Loading required package: BiocGenerics## Loading required package: parallel##
## Attaching package: 'BiocGenerics'## The following objects are masked from 'package:parallel':
##
## clusterApply, clusterApplyLB, clusterCall, clusterEvalQ,
## clusterExport, clusterMap, parApply, parCapply, parLapply,
## parLapplyLB, parRapply, parSapply, parSapplyLB## The following objects are masked from 'package:stats':
##
## IQR, mad, sd, var, xtabs## The following objects are masked from 'package:base':
##
## anyDuplicated, append, as.data.frame, basename, cbind, colnames,
## dirname, do.call, duplicated, eval, evalq, Filter, Find, get, grep,
## grepl, intersect, is.unsorted, lapply, Map, mapply, match, mget,
## order, paste, pmax, pmax.int, pmin, pmin.int, Position, rank,
## rbind, Reduce, rownames, sapply, setdiff, sort, table, tapply,
## union, unique, unsplit, which.max, which.min## Loading required package: Biobase## Welcome to Bioconductor
##
## Vignettes contain introductory material; view with
## 'browseVignettes()'. To cite Bioconductor, see
## 'citation("Biobase")', and for packages 'citation("pkgname")'.Lectura de Ficheros .cel
microarray.row.data<-ReadAffy(verbose=TRUE)## 1 reading C:/Users/Antonio Aguilar/Desktop/Aguilar_Gutierrez_Victor_Antonio_tarea_1/GSM538506.CEL.gz ...instantiating an AffyBatch (intensity a 1004004x6 matrix)...done.
## Reading in : C:/Users/Antonio Aguilar/Desktop/Aguilar_Gutierrez_Victor_Antonio_tarea_1/GSM538506.CEL.gz
## Reading in : C:/Users/Antonio Aguilar/Desktop/Aguilar_Gutierrez_Victor_Antonio_tarea_1/GSM538507.CEL.gz
## Reading in : C:/Users/Antonio Aguilar/Desktop/Aguilar_Gutierrez_Victor_Antonio_tarea_1/GSM538508.CEL.gz
## Reading in : C:/Users/Antonio Aguilar/Desktop/Aguilar_Gutierrez_Victor_Antonio_tarea_1/GSM538509.CEL.gz
## Reading in : C:/Users/Antonio Aguilar/Desktop/Aguilar_Gutierrez_Victor_Antonio_tarea_1/GSM538510.CEL.gz
## Reading in : C:/Users/Antonio Aguilar/Desktop/Aguilar_Gutierrez_Victor_Antonio_tarea_1/GSM538511.CEL.gzDatos de la Placas de microarray utilizadas
microarray.row.data## Warning: replacing previous import 'AnnotationDbi::tail' by 'utils::tail' when
## loading 'mouse4302cdf'## Warning: replacing previous import 'AnnotationDbi::head' by 'utils::head' when
## loading 'mouse4302cdf'## ## AffyBatch object
## size of arrays=1002x1002 features (20 kb)
## cdf=Mouse430_2 (45101 affyids)
## number of samples=6
## number of genes=45101
## annotation=mouse4302
## notes=Nombre de la Placa de Microarray
cdfName(microarray.row.data)## [1] "Mouse430_2"Evaluacion de la calidad de las imagenes de los microarrays.
image(microarray.row.data[,1],col=rainbow(100))
image(microarray.row.data[,2],col=rainbow(100))
image(microarray.row.data[,3],col=rainbow(100))
image(microarray.row.data[,4],col=rainbow(100))
image(microarray.row.data[,5],col=rainbow(100))
image(microarray.row.data[,6],col=rainbow(100))
Las imágenes generadas de la reproducción de la foto tomada por el scanner de fluorescencia de la placa de microarray reflejan que no se han producido daños físicos durante su manejo.
Carga de los paquetes de Affy
library(simpleaffy)## Loading required package: genefilter## Loading required package: gcrma## Warning: Package 'simpleaffy' is deprecated and will be removed from
## Bioconductor version 3.13library(affyPLM)## Loading required package: preprocessCoreAnalisis de calidad
quality.analisis<-qc(microarray.row.data)Graficos de Calidad
plot(quality.analisis)
El grafico de calidad pre-procesamiento prueba que las muestras son de calidad existiendo poca degradacion del RNA de las muestras.Aunque debido a la posibilidad de errores es necesario comprobar la existencia del ruido de fondo y corregirla para un correcto analisis de los datos.
Comrobacion de la existencia de ruido de fondo
boxplot(microarray.row.data,col=rainbow(14),las=2,ylab="Luminescence")
hist(microarray.row.data,col=rainbow(14))
Se pudo comprobar la existencia de Ruido de Fondo por lo que se procede a corregirlo usando la Funcion rma.
microarray.procesed.data<-rma(microarray.row.data)## Background correcting
## Normalizing
## Calculating Expressionrma corrige los datos de fondo, los normaliza y calcula los niveles de expresion con log2.
Graficos de datos corregidos
boxplot(microarray.procesed.data,col=rainbow(8),las=2,ylab="flourescense")
hist(microarray.procesed.data,col=rainbow(8))
Despues de la correccion del ruido de fondo de los datos brutos y en base a la fluorescencia y niveles de expresion concluimos que los datos son comparables entre si.
Estimacion de los niveles de expresion realizada por por rma:
expression.level<-exprs(microarray.procesed.data)
sampleID <- c("Mutant_HCE_1","Mutant_HCE_2","Mutant_HCE_3","Wildtype_HCE_4","Wildtype_HCE_5","Wildtype_HCE_6")
colnames(expression.level)<-sampleID
head(expression.level)## Mutant_HCE_1 Mutant_HCE_2 Mutant_HCE_3 Wildtype_HCE_4
## 1415670_at 11.077359 11.081159 11.125696 11.029951
## 1415671_at 10.652640 10.516205 10.587443 10.441108
## 1415672_at 10.320724 9.955814 10.464700 10.392678
## 1415673_at 7.180136 6.774701 7.279541 7.146380
## 1415674_a_at 9.030151 8.418043 9.038267 8.884392
## 1415675_at 9.048299 8.730862 9.060055 9.164391
## Wildtype_HCE_5 Wildtype_HCE_6
## 1415670_at 11.014436 11.102358
## 1415671_at 10.367537 10.281076
## 1415672_at 10.274113 10.241423
## 1415673_at 7.032048 7.080625
## 1415674_a_at 8.518384 8.427721
## 1415675_at 9.115183 8.817291Valores medios de expresion para cada genotipo.
Mutant_HCE<-(expression.level[,"Mutant_HCE_1"]+expression.level[,"Mutant_HCE_2"]+expression.level[,"Mutant_HCE_3"])/3
Wildtype_HCE<-(expression.level[,"Wildtype_HCE_4"]+expression.level[,"Wildtype_HCE_5"]+expression.level[,"Wildtype_HCE_6"])/3
mean.expression<-matrix(c(Mutant_HCE,Wildtype_HCE),ncol=2)
conditionsID<-c("Mutant_HCE","Wildtype_HCE")
rownames(mean.expression)<-names(Mutant_HCE)
colnames(mean.expression)<-conditionsID
head(mean.expression)## Mutant_HCE Wildtype_HCE
## 1415670_at 11.094738 11.048915
## 1415671_at 10.585429 10.363240
## 1415672_at 10.247079 10.302738
## 1415673_at 7.078126 7.086351
## 1415674_a_at 8.828820 8.610165
## 1415675_at 8.946405 9.032288Análisis de Expresión Génica Diferencial
Para determinar los genes expresados de forma diferencial y su posterior criterio de selección, se concideran las siguientes comparaciones:
- Mutant_HCE / Wildtype_HCE
Para el analisis de la DEG se utilizara el metodo basado en Fold-Change puesto que solo se evaluan 2 condiciones de un organismo (Mus musculus) cuyo genoma es ampliamente conocido y con el que no son necesarias una enorme cantidad de muestras.
Con la comparacion entre el mutante y el tipo silvestre se busca determinar que genes se ven alterados en su funcion ante la ablacion de Bcl9/Bcl9l.Por lo cual se procede a establecer el diseño experimental y el cálculo del fold-change y p-valores de los genes de las muestras comparadas.
library(limma)##
## Attaching package: 'limma'## The following object is masked from 'package:BiocGenerics':
##
## plotMAexperimental.design<-model.matrix(~ -1+factor(c(1,1,1,2,2,2)))
colnames(experimental.design)<-c("Mutant_HCE","Wildtype_HCE")
linear.fit <- lmFit(expression.level, experimental.design)contrast.matrix<- makeContrasts(Mutant_HCE-Wildtype_HCE,levels =c("Mutant_HCE","Wildtype_HCE"))
contrast.linear.fit<-contrasts.fit(linear.fit,contrast.matrix)
contrast.results<-eBayes(contrast.linear.fit)Tabla con la expresión diferencial de los genes en la comparación
Mutant_Wildtype_HCE <- topTable(contrast.results,number=45101,coef=1,sort.by="logFC")
head(Mutant_Wildtype_HCE)## logFC AveExpr t P.Value adj.P.Val B
## 1428209_at -3.735225 5.961150 -7.246959 0.0002011219 0.7559000 -3.413897
## 1435012_x_at -3.258953 6.584003 -1.411177 0.2025102688 0.9906242 -4.490528
## 1416055_at -3.135160 7.698952 -1.467768 0.1870853828 0.9906242 -4.470319
## 1422435_at -2.836011 5.509904 -1.940349 0.0949507937 0.9906242 -4.300081
## 1415954_at -2.815256 5.629016 -2.021781 0.0843447006 0.9906242 -4.271326
## 1448872_at 2.772172 8.888164 2.988455 0.0211167994 0.9906242 -3.969236Para la expresion diferencial de genes usando el método basado en el fold-change (factor de proporcionalidad), se fija un umbral de 2 (1 para nuesto codigo ya que trabajamos con log2(2)), siendo interpretable biológicamente de forma directa como que los genes se expresan el doble o menos de la mitad.
fold_change_Mutant_Wildtype_HCE <- Mutant_Wildtype_HCE$logFC
genes.ids.Mutant.Wildtype.HCE <- row.names(Mutant_Wildtype_HCE)
activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE <- genes.ids.Mutant.Wildtype.HCE[fold_change_Mutant_Wildtype_HCE> 1]
repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE <- genes.ids.Mutant.Wildtype.HCE[fold_change_Mutant_Wildtype_HCE< -1]Genes Activados
length(activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE)## [1] 66Genes Reprimidos
length(repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE)## [1] 311Existen 66 genes activados y 311 reprimidos por la ablacion de Bcl9/Bcl9l tal como se muestra en la siguiente grafica:
plot(Wildtype_HCE,Mutant_HCE,pch=19,cex=0.5,col="black", xlab="Wildtype HCE",ylab="Mutant HCE")
points(Wildtype_HCE[activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE],Mutant_HCE[activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE],pch=19,cex=0.5,col="blue")
points(Wildtype_HCE[repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE],Mutant_HCE[repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE],pch=19,cex=0.5,col="red")
Acontinuacion se marcan los genes mas representativos de esta comparacion.
plot(Wildtype_HCE,Mutant_HCE,pch=19,cex=0.5,col="black", xlab="Wildtype HCE",ylab="Mutant HCE")
points(Wildtype_HCE[activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE],Mutant_HCE[activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE],pch=19,cex=0.5,col="blue")
points(Wildtype_HCE[repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE],Mutant_HCE[repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE],pch=19,cex=0.5,col="red")
text(Wildtype_HCE["1448872_at"]+0.3,Mutant_HCE["1448872_at"]+0.3,"Reg3g", col="black", cex=0.7)
text(Wildtype_HCE["1417160_s_at"]+0.3,Mutant_HCE["1417160_s_at"]+0.3,"Wfdc18", col="black", cex=0.7)
text(Wildtype_HCE["1419209_at"]+0.3,Mutant_HCE["1419209_at"]+0.3,"Cxcl1", col="black", cex=0.7)
text(Wildtype_HCE["1428209_at"]+0.3,Mutant_HCE["1428209_at"]+0.3,"Bex4", col="black", cex=0.7)
text(Wildtype_HCE["1422435_at"]+0.3,Mutant_HCE["1422435_at"]+0.3,"2210010C04Rik", col="black", cex=0.7)
text(Wildtype_HCE["1438751_at"]+0.3,Mutant_HCE["1438751_at"]+0.3,"Slc30a10", col="black", cex=0.7)
Entre los genes activados podemos encontrar
Reg3g involucrado en la respuesta contra bacterias gram-positivas,etc.
Wfdc18 involucrado en actividad inhibidora de endopeptidasa de tipo serina,etc.
Cxcl1 involucrado en Respuesta inmune humoral antimicrobiana mediada por péptido antimicrobiano,etc.
Entre los genes reprimidos podemos encontrar
Bex4 involucrado en la regulación del ciclo celular mitótico, la migración celular, etc.
2210010C04Rik involucrado en actividad inhibidora de endopeptidasa de tipo serina, etc.
Slc30a10 involucrado en actividad transportadora transmembrana de iones de zinc, etc.
A continuación se enlazan los ficheros en formato txt y html con las listas de los genes expresados de forma diferencial.
library(annaffy)## Loading required package: GO.db## Loading required package: AnnotationDbi## Loading required package: stats4## Loading required package: IRanges## Loading required package: S4Vectors##
## Attaching package: 'S4Vectors'## The following object is masked from 'package:base':
##
## expand.grid##
## Attaching package: 'IRanges'## The following object is masked from 'package:simpleaffy':
##
## members## The following object is masked from 'package:grDevices':
##
## windows## ## Loading required package: KEGG.db##
## KEGG.db contains mappings based on older data because the original
## resource was removed from the the public domain before the most
## recent update was produced. This package should now be considered
## deprecated and future versions of Bioconductor may not have it
## available. Users who want more current data are encouraged to look
## at the KEGGREST or reactome.db packages## Warning: Package 'KEGG.db' is deprecated and will be removed from Bioconductor
## version 3.12activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE.table<- aafTableAnn(activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE, "mouse4302.db", aaf.handler())## Loading required package: mouse4302.db## Loading required package: org.Mm.eg.db## ## ## Warning in chkPkgs(chip): The mouse4302.db package does not appear to contain
## annotation data.## Warning in result_fetch(res@ptr, n = n): SQL statements must be issued with
## dbExecute() or dbSendStatement() instead of dbGetQuery() or dbSendQuery().
## Warning in result_fetch(res@ptr, n = n): SQL statements must be issued with
## dbExecute() or dbSendStatement() instead of dbGetQuery() or dbSendQuery().saveHTML(activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE.table,file="activated.Mutant.Wildtype.HCE.html")
saveText(activated.genes.Mutant.Wildtype.HCE.table,file="activated.Mutant.Wildtype.HCE.txt")
repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE.table<- aafTableAnn(repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE, "mouse4302.db", aaf.handler())
saveHTML(repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE.table,file="repressed.Mutant.Wildtype.HCE.html")
saveText(repressed.genes.Mutant.Wildtype.HCE.table,file="repressed.Mutant.Wildtype.HCE.txt")Enlaces en formato .html
Enlances en formato .txt
Diagramas de Venn
La comparacion del Diagrama de Venn se ralizo entre Genoma Completo de Mus musculus y los genes activados y reprimidos respectivamente. Con el fin de determinar el porcentaje del genoma que representa cada uno. Se utilizo la pagina web https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ para ralizar los diagramas.
Existen 66 genes activados en total, sin embargo solo 52 estan plenamente identificados y de estos solo 38 son conocidos con anterioridad, los restantes 13 genes activados puede que hallan cambiado de nombre recientemente o que sean exclusivos del mutante que se esta estudiando, estos son: Wfdc18, Wfdc17, Eef1akmt1, Tnfsf13os, Ssc4d, Tpgs2, Rmdn2, Pum3, Clca4b, Ajuba, C1qtnf12, Rad51d, Peak1.
Y los faltantes 14 genes aun no tienen nombre de identificacion por lo que no pudieron ser comparados. Los Genes activados representan menos del 1% del genoma.
Diagrama de Venn - Genes Reprimidos
Existen 311 reprimidos por la ablacion de Bcl9/Bcl9l de estos 203 estaban identificados con anterioridad en el genoma de Mus musculus, mientras que 13 no se encontraban previamente identificados o pueden haber cambiado de nombre recientemente, estos son: Rgcc, Cyria, Ackr3, Ifi209, Golm2, Insyn2b, Fcmr, Sptssb, C1s1, 2010309G21Rik, Marchf1, Minar1, Nrep.
94 genes no tenian nombre y no pudieron ser comparados. Los genes reprimidos representan el 1% del genoma.
La lista utilizada para obtener el genoma de Mus musculus usado para el background es del año 2014 por lo que no esta actualizada con los cambios de nombres. Por ejemplo, el Gen activado Wfdc18 era anteriormente conocido como Expi, en la lista no aparece Wfdc18 pero si Expi.
Análisis de Enriquecimiento de Términos de Ontología Génica
La Ontología genica permite utilizar un vocabulario unificado de los genes y de los productos génicos tales como: procesos biológicos, funciones moleculares o componestes celulares con una organización jerarquica que va desde lo mas general a lo mas específico. La importancia del análisis de enriquecimiento de Ontología Génica radica en la posibilidad de incorporar sistemáticamente información de genes, de incluir su significancia estadística con respecto a un grupo total de genes e integrar las relaciones lógicas que los conectan.
Analisis Ontogenico
El analisis con GOrilla muestra que el proceso con mayor sifnificancia es la respuesta humoral antimicrobiana, regulada por los genes:
Cxcl1 - chemokine (c-x-c motif) ligand 1.
Reg3g - regenerating islet-derived 3 gamma.
Wfdc17 - wap four-disulfide core domain 17.
Wfdc18 - wap four-disulfide core domain 18.
Reg3b - regenerating islet-derived 3 beta.
Este resultado se reafirma con el analisis utilizando la herramienta RevIGO:
Treemap Generado con RevIGO
Tabla resumen conjuntos de genes activados utilizando la herramienta RevIGO
| Termino de GO | q-Value | Descripción del término de GO | Genes Representativos |
|---|---|---|---|
| GO:0019730 | 7.22E-2 | Antimicrobial humoral response | Cxcl1, Reg3g, Wfdc17, Wfdc18, Reg3b. |
| GO:0044278 | 3.45E-1 | Cell wall disruption in other organism | Reg3g, Reg3b. |
| GO:0060708 | 4.61E-1 | Spongiotrophoblast differentiation | Lif, Socs3. |
| GO:0006312 | 9.88E-1 | Mitotic recombination | Brca2, Rad51d |
| GO:0000280 | 9.41E-1 | Nuclear division | Rec8, Brca2, Ncaph. |
Conclusiones
En el estudio se seleccionaron de antemano marcadores de celulas madres del colon para hacer las comparaciones entre el Wildtype y el mutante dejando de lado el hecho de que la ablacion de Bcl9/Bcl9l produce una respuesta en el organismo similar a la que se tendria en caso de una infeccion bacteriana. Por lo que las celulas del epitelio del colon estan en constante estado de defensa al no existir una regulacion adecuada de las rutas Wtn. Esta alteracion puede afectar el colon aunque no existan alteraciones fenotipicas significativas.
Referencias
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Bolstad, B. (2004) Low Level Analysis of High-density Oligonucleotide Array Data: Background, Normalization and Summarization. Dissertation. University of California, Berkeley.
Bolstad, B; Collin, F; Brettschneider, J; Simpson, K; Cope, L; Irizarry, R; Speed, T. (2005) Quality Assessment of Affymetrix GeneChip Data in Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor.
Brembeck FH, Schwarz-Romond T, Bakkers J, Wilhelm S, Hammerschmidt M, Birchmeier W. (2004) Essential role of BCL9-2 in the switch between β-catenin’s adhesive and transcriptional functions. Genes Dev; 18:2225–30.
Clevers H.(2006). Wnt/β-catenin signaling in development and disease. Cell; 127:469–80.
Deka J, Wiedemann N, Anderle P, Murphy-Seiler F, Bultinck J, Stehle J, André S, Vilain N, Zilian O, Robine S, Delorenzi M, Basler K, Aguet M. (2010). Bcl9/Bcl9l Are Critical for Wnt-Mediated Regulation of Stem Cell Traits in Colon Epithelium and Adenocarcinomas. Cancer Res; 70(16):6619-28.
Eden, E; Navon, R; Steinfeld, I; Lipson, D; Yakhini, Z. (2009) “GOrilla: A Tool For Discovery And Visualization of Enriched GO Terms in Ranked Gene Lists”. BMC Bioinformatics, 10:48.
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