Respuesta ecotoxicológica de la microalga Scenedesmus sp. ante agua del río Pirro
Dennis Blanco Pérez, Adriana Fallas Méndez, Yorshua Gonzales Castro, Nazaret Porras Araya y Katherine Valverde Madrigal
3 de noviembre de 2018
Resumen
Palabras clave: Scenedesmus sp., ecotoxicología y crecimiento celular.
Introducción
En los últimos años el uso de microalgas en estudios toxicológicos ha adquirido gran popularidad entre los científicos debido a su alta distribución, capacidad mixotrófica, papel en el almacenamiento y transformación de carbono y la utilización de biomasa en la producción de bioenergía. Las microalgas son el productor primario en cadenas alimenticias acuáticas y se ha propuesto que son el indicador biológico de calidad de agua y ecotoxicidad de productos químicos mas importante que existe (Xiong, 2018).
Algunas microalgas son consideradas modelos específicos de estudio para la realización de bioensayos de toxicidad, esto se debe a diversos factores como su alta sensibilidad frente a diversas sustancias químicas, sus requerimientos nutricionales son conocidos, poseen una alta tasa de crecimiento lo cual permite canalizar en relativamente pocos días la densidad y el efecto causado por el agente tóxico y su manipulación resulta ser relativamente sencilla en el laboratorio (Castillo & Vila, 2000).
Según Schiewer (2000) las comunidades de algas responden por lo general a cambios en el medio ocasionados por el ser humano, como exceso de nutrientes y substancias tóxicas, convirtiéndolos en buenos indicadores de cambios en la calidad del agua. Sus ciclos de vida cortos las hace indicadoras adecuadas para efectos a corto plazo, los hábitos de fijación de la mayoría de las especies hacen que sean afectadas directamente por los cambios físicos y químicos en la columna del agua; por ser productores primarios son sensibles a contaminantes que no tienen efecto sobre organismos heterotróficos y además su muestreo resulta fácil y sencillo.
Siguiendo la misma línea, se han realizado diversos estudios para medir la capacidad de distintas microalgas de absorber metales del agua, como pueden ser: Cu, Cd, Cr, Se y Zn sometiendo a las algas a diferentes concentraciones de dichos metales y evaluando su nivel de respuesta. Se ha encontrado que en muchas especies el nivel de metales pesados en las algas refleja la concentración de los mismos en el ambiente, lo cual es útil no solo para el estudio toxicológico de estas sustancias sino tambien para evaluar el nivel de estos metales o contaminantes presentes en el medio natural. Los contaminantes orgánicos en el medio acuático son biodegradados por diversos microorganismos, incluyendo algas, las cuales han demostrado que son capaces de biotransformar y biodegradar contaminantes aromáticos comúnmente encontrados en aguas naturales y residuales.
Las microalgas proveen de carbono reducido y nitrógeno a la microbiota presente en los ecosistemas acuáticos, lo que incrementa el potencial de degradación y eliminación de contaminantes. (Alvares, 2004).
La microcuenca del río Pirro se ubica en la provincia de Heredia, en la vertiente Pacífica de Costa Rica, políticamente, está formada por tres cantones: San Rafael, Heredia y San Pablo. En los últimos años ha sido objeto de estudio en el análisis de efectos antropogénicos debido a su elevada contaminación (Castro et al., 2016).
El uso del suelo en esta microcuenca está caracterizado por urbanismo (70%), cafetales (18%), pastos y vegetación (6% cada uno); esto permite afirmar que la microcuenca del río Pirro es típicamente urbana (Miranda et al, 2010).
“Su cauce principal presenta obras de entubamiento desde su naciente y, además, está catalogado como un cauce intermitente, lo que quiere decir que únicamente en época lluviosa presenta caudal; sin embargo, debido al vertedero de aguas servidas, este río presenta un caudal permanente” (Romero et al., 2011).
Estudios como el realizado por Herrera et al., (2013) revelan la presencia de altas cantitades de metales pesados como lo son: Cd, Ag, Se, Sn, Ni, Cr, Cu, B, Zn, Hg, Ba, Pb, Mn, As y Al en los sedimentos superficiales del sector medio del río Pirro provenientes de actividades de origen antropogénico, como desechos domésticos, industriales y de actividades agrícolas, los cuales representan un peligro para la fauna acuática y el ser humano ya que alteran el equilibrio ecológico y bioquímico del ecosistema.
Objetivo general
Analizar la respuesta ecotoxicológica del alga Scenedesmus sp. ante muestras de agua contaminada provenientes del río Pirro.
Objetivos específicos
. Comparar la tasa de crecimiento de la microalga a diferentes concentraciones de agua contaminada proveniente del río Pirro.
. Evaluar la respuesta fisiológica de la microalga ante el agua contaminada.
. Explicar el porqué del crecimiento de Scenedesmus sp. en dicha agua.
Metododología
Área de estudio
Esta investigación se llevó a cabo en la cuenca del río Pirro, en el distrito de Heredia, Heredia, Costa Rica. Presenta una superficie de 7,3 km² con una elevación máxima de 1420 m.s.n.m y una mínima de 1050 m.s.n.m. La temperatura promedio anual es de 20,1ºC, la humedad relativa promedio es de 79%, con una precipitación promedio anual de 2374,3 mm.
El análisis de las muestras se realizó en el Laboratorio de Microalgas (LABMA), Escuela de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica.
Diseño experimental
El experimento se realizó durante 9 días; el primer día se recolectó muestras de agua del río Pirro y se autoclavó con el fin de eliminar cualquier tipo de organismo secundario que pudiera afectar la muestra; tales como bacterias, hongos u otras algas. Posteriormente se dejó reposar y enfriar durante 24 horas.
En el tercer día se procedió a preparar los tubos de ensayo con las distintas concentraciones; 4 tubos de ensayo únicamente con 10 mL de agua destilada, 4 tubos de ensayo con 10 mL de la sustancia de control positivo BBM, 6 tubos con 5 mL de agua destilada y 5 mL de agua del río Pirro, 6 tubos con 2,5 mL de agua del río Pirro y 7,5 mL de agua destilada y por último 6 tubos con 10 mL de agua del río Pirro y a cada uno de estos tubos se le agregó 1 ml de la microalga Scenedesmus sp.. Los tratamientos se rotularon con la letra T y las concentraciones con la letra C. Se utilizó un control positivo para observar la curva que presentaba la microalga en un medio ideal para propiciar su crecimiento y el control negativo para verificar que el experimento iba de manera correcta, ya que si éste presenta crecimiento continuo, estaría evidenciando que algo se llevó de manera errónea.
Los conteos se realizaron con ayuda de un microscopio y una cámara de Neubauer; se tomó la muestra de 20 µl con ayuda de la micropipeta de cada tubo de ensayo para un total de 26 muestras, a las cuales se les realizó 3 conteos, para un total de 78 conteos al día. Seguido, se colocó la muestra en la cámara de Neubauer, se tapó con un cubre objetos y fue colocada al microscopio a un aumento de 10x. El conteo se realizó en los cuadros que se encuentran en las esquinas de la cámara y en el centro de la misma. El mismo procedimiento se realizó durante 7 días.
Ánalisis de resultados
La comparación del número de células vivas en los diferentes tratamientos fue evaluado a través del análisis de varianza de una vía (ANDEVA) mediante el método estadístico de Shapiro para saber la normalidad de los residuos; de acuerdo al p-value, se procedió con las pruebas para determinar si en los datos habían diferencias estadísticamente significativas y posterior a ello, se realizó comparaciones a posteriori entre medias con la prueba de LSD (a=0.005) dado que la cantidad de datos eran desbalanceados. Todos los análisis estadísticos fueron realizados con la ayuda de lenguaje de programación de R, versión 3.4.3 (RCoreTeam, 2017).
Resultados
Se encontró, para el día 1, diferencias estadísticamente significativas en el número de células vivas entre los tratamientos (KW= 26.215; g.l= 4,177; p<0.05) (figura 1). No se encontró diferencias significativas entre los tratamientos (LSD, p>0.05): T50-C+, T50-T100, T50-T25, T25-C- y T100-C+.
Fig1. Número de células vivas de Scenedesmus sp. bajo cinco tratamientos de diferentes concentraciones en el día 1. Se presentó diferencias estadistícamente significativas, pruebra de Kruskal-Wallis p<0.05.
Con respecto al día 2, se presentó diferencias estadísticamente significativas para la cantidad de células vivas entre los tratamientos (F= 3.2181; g.l= 4,177; p<0.05) (figura 2); se encontró diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (LSD, p<0.05): T100-C-, C+ - C-, T25-C+, T25-T100 y T50-C+.
Fig2. Número de células vivas de Scenedesmus sp. bajo cinco tratamientos de diferentes concentraciones en el día 2. Se presentó diferencias estadistícamente significativas, pruebra de Fisher p<0.05.
En el día 3, se mostró diferencias estadísticamente significativas para la variable del número de células vivas entre los tratamientos (F= 3.2435, g.l= 4,177; p<0.05) (figura 3); las diferencias estadísticamente significativas encontradas entre tratamientos (LSD, p<0.05): C+-T100 y C+ - C-.
Fig3. Número de células vivas de Scenedesmus sp. bajo cinco tratamientos de diferentes concentraciones en el día 3. Se presentó diferencias estadistícamente significativas, pruebra de Fisher p<0.05.
De acuerdo con el día 4, se observó diferencias estadísticamente significativas para los tratamientos (F= 6.2475; g.l= 4,177; p<0.05) (figura 4). No se encontró diferencias significativas entre los tratamientos (LSD, p>0.05): T25-C-, T50-C+, T100-C+ y T50-T100.
Fig4. Número de células vivas de Scenedesmus sp. bajo cinco tratamientos de diferentes concentraciones en el día 4. Se presentó diferencias estadistícamente significativas, pruebra de Fisher p<0.05.
Según el día 5, no se encontró diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos para la variable de la cantidad de células vivas (KW= 4.3011; g.l= 4,177; p>0.05) (figura 5).
Fig5. Número de células vivas de Scenedesmus sp. bajo cinco tratamientos de diferentes concentraciones en el día 5. No se presentó diferencias estadistícamente significativas, pruebra de Kruskal-Wallis p>0.05.
La variable número de células vivas, en el día 6, presentó diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (KW= 29.712; g.l= 4,177; p<0.05) (figura 6); las diferencias encontradas entre tratamientos (LSD, p<0.05): C+ - C-, C+ - T25, T100-C-, T100-T25, T25-C+, T50-C-, T50-T25.
Fig6. Número de células vivas de Scenedesmus sp. bajo cinco tratamientos de diferentes concentraciones en el día 6. No se presentó diferencias estadistícamente significativas, pruebra de Kruskal-Wallis p<0.05.
Se encontró diferencias estadísticamente significativas, en el día 7, en el número de células vivas entre los tratamientos (F= 13.485; g.l= 4,177 ; p<0.05) (figura 7). No se encontró diferencias significativas entre los tratamientos (LSD, p>0.05): T100-C+, T25-C+, T50-C+, T25-T100 y T50-T100.
Fig7. Número de células vivas de Scenedesmus sp. bajo cinco tratamientos de diferentes concentraciones en el día 7. No se presentó diferencias estadistícamente significativas, pruebra de Fisher p<0.05.
Se presentó diferencias estadísticamente significativas entre los 7 días bajo diferentes tratamientos (g.l= 4,177; p<0.05) (figura 8).
Discusión
En el primer día de conteo, las diferencias significativas del C+ y T100 con respecto a los tratamientos T50 y T25, se debieron a que hubo un mayor crecimiento del C+ y T100; en el caso del C+, su respuesta se debió a que las algas se encontraban en un medio ideal para su crecimiento. Con respecto a T100, se debió a su alta tolerancia y adaptación a aguas residuales (Borowitzka, 1999), pudiendo absorber rápidamente nutrientes, debido a que este estaba repleto de compuestos que la microalga utiliza para sus procesos metabólicos como N, P y metales pesados (Herrera et al.,2013).
Scenedesmus sp. resulta ser afín a los iones de metales pesados debido a su carga superficial negativa (Voltolina, 1998), lograda principalmente por un grupo funcional que puede ser encontrado en el alga llamado alginato. Este posee una elevada densidad electrónica, responsable de su alta efectividad en la absorción de metales por el intercambio iónico que se da en la solución con el metal (Cuizano, 2008). Por esa razón, el corto tiempo que pasó para la realización del primer conteo, fue necesario para que las algas empezaran a absorber los nutrientes y a dividirse, aumentando el número de células en el conteo, mientras que, en los otros tratamientos, al no poseer tantos nutrientes, no fue suficiente el tiempo transcurrido para el inicio de su crecimiento.
En los siguientes días, el crecimiento de las algas entre el T100 y C+ no presentó diferencia significativas, con excepción del día 3, en donde el crecimiento del C+ decreció; esto se debe a que las microalgas que estaban en esta solución se encontraban en un medio óptimo para su crecimiento, por lo que no debieron adaptarse ni responder ante un ambiente hostil(Borowitzka, 1999).
El C- presentó un crecimiento inestable debido a que esta microalga se encontraba en un medio sin nutrientes, donde le fue imposible llevar acabo sus procesos metabólicos, por lo que se adaptó para usar sus nutrientes de reserva (Marcano et al., 2007). Su división celular en promedio fue menor, en comparación con los otros tratamientos, hasta el sexto día, en donde presentó diferencias significativas con todos los tratamientos, con excepción del T25, lo cual se debe a que en ambas muestras, las células empezaron a morir ante la falta de nutrientes necesarios para su desarrollo. El día del conteo final, se pudo evidenciar que el C- presentaba diferencias significativas respecto a los demas tratamientos, esto debido a la misma falta de nutrientes en este medio.
Bibliografía
An, H., Liu, H., Dong, Y., Chen, C., Wang, Z., Guo, J., & Du, S. (2019). Growth inhibition and oxidative stress caused by four ionic liquids in Scenedesmus obliquus: Role of cations and anions. Science of The Total Environment, 651, 570-579.
Álvarez, N. O. (2004). Alternativas de monitoreo de calidad de aguas: algas como bioindicadores. Revista Acta Nova, 2(4).
Borowitzka MA. 1999. Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and fermenters. Journal of Biotechnology 70: 313-332.
Castillo, G.C. & I.C. Vila. 2000. Ecotoxicity assessment of metals and wastewater using multitrophic assays. Environ. Toxicol., 15: 370-375
Castro, L. P., Vargas, M. R., Campos, L. O. (2016). Las cuencas urbanas y su fauna: el caso del río Pirro, Heredia, Costa Rica. Biocenosis, Vol. 31 (1-2).
Cuizano, N. A., & Navarro, A. E. (2008). Biosorción de metales pesados por algas marinas: posible solución a la contaminación a bajas concentraciones. In Anales de la Real Sociedad Española de Química (No. 2, pp. 120-125). Real Sociedad Española de Química.
Herrera-Núñez, J., Rodríguez-Corrales, J., Coto-Campos, J. M., Salgado-Silva, V., & Borbón-Alpízar, H. (2013). Evaluación de metales pesados en los sedimentos superficiales del río Pirro. Revista Tecnología en Marcha, 26(1), 27-36.
Marcano, L., Carruyo, I., Montiel, X., Morales, C., & Moreno, P. (2007). Capacidad de adaptación al estrés inducido por cadmio de dos especies de microalgas (Dunaliella viridis y Scenedesmus sp.). Acta Microscópica, 16(2), 113-119.
Miranda, O., Solano, V. y Balmaceda, G. (2010). II Taller: Construyendo acciones para la recuperación del río Pirro, Costa Rica. Universidad Nacional.
Romero, M. (2008). Diagnóstico físico-ambiental de la microcuenca del río Pirro. Informe final de Proyecto. Escuela de Ciencias Geográficas, Universidad Nacional-Costa Rica.
S. Schiewer and M.H. Wong. (2000). Ionic strength effects in biosoportion of metals by marine algae. Chemosphere, (41):271-282.
Voltolina D, B Cordero, M Nieves & LP Soto. 1998. Growth of Scenedesmus sp. in artificial wastewater. Bioresource Technology 68: 265-268.
Zhou, H., Xiang, N., Xie, J., & Diao, X. (2013). Ecotoxicology: The History and Present Direction.
Anexos
adia1<-aov(Microalgas~Concentraciones)
summary(adia1)
shapiro.test(adia1$residuals)
tapply(Microalgas, Concentraciones, length)
kruskal.test(Microalgas~as.factor(Concentraciones))
pairwise.wilcox.test(Microalgas,Concentraciones, p.adjust.method = "none")
comparacion.LSD<-pairwise.wilcox.test(Microalgas,Concentraciones, p.adjust.method = "none")
ifelse(comparacion.LSD$p.value>0.05, "Igual","Diferente")
ggplot(data = Dia1) +
aes(x = Concentraciones, y = Microalgas, fill = Concentraciones) +
geom_boxplot() +
scale_fill_brewer(palette = "YlOrRd") +
labs(x = "Tratamientos",
y = "N° células vivas/mm^3") +
theme_minimal()
adia2<-aov(Microalgas~Concentraciones)
summary(adia2)
shapiro.test(adia2$residuals)
oneway.test(Microalgas~Concentraciones)
pairwise.t.test(Microalgas,Concentraciones, p.adjust.method = "none", exact=F )
comparacion.LSD<-pairwise.t.test(Microalgas,Concentraciones, p.adjust.method = "none")
ifelse(comparacion.LSD$p.value>0.05, "Igual","Diferente")
ggplot(data = Dia2) +
aes(x = Concentraciones, y = Microalgas, fill = Concentraciones) +
geom_boxplot() +
scale_fill_brewer(palette = "YlOrRd") +
labs(x = "Tratamientos",
y = "Crecimiento (N° células vivas/mm^3)") +
theme_minimal()
adia3<-aov(Microalgas~Concentraciones)
summary(adia3)
shapiro.test(adia3$residuals)
oneway.test(Microalgas~Concentraciones)
pairwise.t.test(Microalgas,Concentraciones, p.adjust.method = "none", exact=F)
comparacion.LSD<-pairwise.t.test(Microalgas,Concentraciones, p.adjust.method = "none")
ifelse(comparacion.LSD$p.value>0.05, "Igual","Diferente")
ggplot(data = Dia3) +
aes(x = Concentraciones, y = Microalgas, fill = Concentraciones) +
geom_boxplot() +
scale_fill_brewer(palette = "YlOrRd") +
labs(x = "Tratamientos",
y = "N° células vivas/mm^3") +
theme_minimal()
adia4<-aov(Microalgas~Concentraciones)
summary(adia4)
shapiro.test(adia4$residuals)
oneway.test(Microalgas~Concentraciones)
pairwise.t.test(Microalgas,Concentraciones, p.adjust.method = "none", exact=F)
comparacion.LSD<-pairwise.t.test(Microalgas, Concentraciones, p.adjust.method = "none")
ifelse(comparacion.LSD$p.value>0.05, "Igual","Diferente")
ggplot(data = Dia4) +
aes(x = Concentraciones, y = Microalgas, fill = Concentraciones) +
geom_boxplot() +
scale_fill_brewer(palette = "YlOrRd") +
labs(x = "Tratamientos",
y = "Microalgas (mm^3)") +
theme_minimal()
adia5<-aov(Microalgas~Concentraciones)
summary(adia5)
shapiro.test(adia5$residuals)
kruskal.test(Microalgas ~ as.factor(Concentraciones))
ggplot(data = Dia5) +
aes(x = Concentraciones, y = Microalgas, fill = Concentraciones) +
geom_boxplot() +
scale_fill_brewer(palette = "YlOrRd") +
labs(x = "Tratamientos",
y = "Microalgas (mm^3)") +
theme_minimal()
adia6<-aov(Microalgas~Concentraciones)
summary(adia6)
shapiro.test(adia6$residuals)
kruskal.test(Microalgas ~ as.factor(Concentraciones))
comparacion.LSD<-pairwise.wilcox.test(Microalgas, Concentraciones, p.adjust.method = "none")
ifelse(comparacion.LSD$p.value>0.05, "Igual","Diferente")
ggplot(data = Dia6) +
aes(x = Concentraciones, y = Microalgas, fill = Concentraciones) +
geom_boxplot() +
scale_fill_brewer(palette = "YlOrRd") +
labs(x = "Tratamientos",
y = "N° células vivas/mm^3") +
theme_minimal()
adia7<-aov(Microalgas~Concentraciones)
summary(adia7)
shapiro.test(adia7$residuals)
oneway.test(Microalgas~Concentraciones)
aa<-pairwise.t.test(Microalgas,Concentraciones, p.adjust.method = "none", exact=F )
comparacion.LSD<-pairwise.t.test(Microalgas, Concentraciones, p.adjust.method = "none")
ifelse(comparacion.LSD$p.value>0.05, "Igual","Diferente")
ggplot(data = Dia7) +
aes(x = Concentraciones, y = Microalgas, fill = Concentraciones) +
geom_boxplot() +
scale_fill_brewer(palette = "YlOrRd") +
labs(x = "Tratamientos",
y = "N° células vivas/mm^3") +
theme_minimal()
ggplot(data = datos) +
aes(x = Concentraciones, y = Microalgas, fill = Dia) +
geom_boxplot() +
labs(x = "Tratamientos",
y = "N° células vivas/mm^3") +
theme_minimal()