Toxicidad del agua del río Pirro en Daphnia pulex
Guevara Francesa Giuliana, Monge Jiménez Alexander, Rojas Morales Jose, Vargas Solorzano Isaac
29 de octubre de 2018
Escuela de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Costa Rica.
Resumen
El río Pirro es una microcuenca de la vertiente Pacífica, que presenta elevaciones entre lo 1100 y los 1400 msnm. Su sistema fluvial es geomorfológicamente joven, presenta obras de entubamiento desde su naciente y está rodeado en su mayoría por asentamientos urbanos y plantaciones. Esto provoca una baja regulación ambiental lo que desemboca en una alta presencia de sustancias contaminantes. Daphnia pulex es un organismo modelo para los ensayos de toxicidad debido a su corto periodo de vida y a su gran resistencia a diversos parámetros, así como su susceptibilidad a diversas sustancias contaminantes. Se realizaron muestreos del agua del río Pirro en tres sitios a diferente altitud y se midieron los parámetros fisicoquímicos, se inocularon 10 daphnias en cada pozo de una placa para ensayos y se realizaron conteos a las 24 y 48 horas, se realizaron análisis estadísticos para cada conteo. En ambos conteos Heredia y Guararí presentaron alta mortalidad, mientras que Control y San Rafael presentaron baja mortalidad. los parámetros fisicoquímicos no fueron considerados como fuente de mortalidad, dejando a la contaminación como único parámetro. Se concluye que los parámetros fisicoquímicos no influyen en la mortalidad, además el nivel de contaminación aumenta conforme decrece la altitud. Se recomienda realizar más estudios a este respecto.
Palabras clave
Daphnia pulex, río Pirro, toxicidad, bioensayo, tasa de mortalidad, sobrevivientes.
Introducción:
La microcuenca urbana del río Pirro se ubica en la provincia Heredia, pertenece a la vertiente Pacífica de Costa Rica. Políticamente, está formada por tres cantones: San Rafael, Heredia y San Pablo. La precipitación anual es de entre 2000 a 3000 mm con una temperatura media anual que fluctúa entre los 18 a 20°C siendo los meses de setiembre y octubre los más lluviosos (Romero et al, 2011). Presenta una elevación de entre 1100 a 1400 m.s.n.m. Se ubica en la zona de vida bosque húmedo premontano, forma parte del Relleno Volcánico del Valle Central (Ortiz 2008). El sistema fluvial del río Pirro es geomorfológicamente muy joven (Cuaternario), caracterizado por procesos erosivos propios de cuenca alta, procesos ocurridos sobre rocas volcánicas coladas de lava, tobas y material no consolidado. (Romero et al,.2011).
Su cauce principal presenta obras de entubamiento desde su naciente y, además, está catalogado como un cauce intermitente, lo que quiere decir que únicamente en época lluviosa presenta caudal, sin embargo, debido al vertedero de aguas servidas, este río presenta un caudal permanente. Presenta una vegetación diversa, incluyendo herbáceas, árboles y arbustos, que corresponden a especies dispersas localizadas en las márgenes del cauce principal, mayormente en zonas con una pendiente pronunciada. (Romero et al., 2011).
Según Miranda et al. (2010), el área total de la cuenca es de 7,3 km2 donde el uso del suelo en esta microcuenca está caracterizado por urbanismo (70%), cafetales (18%), pastos y vegetación (6% cada uno), dando a entender que esta microcuenca es típicamente urbana. Es por esta razón que el uso del suelo en estas áreas tiende a comprometer los servicios ambientales, incluyendo la biodiversidad (Pisanty et al., 2009).
El área en que se encuentra la microcuenca del río Pirro, inmersa en la ciudad de Heredia ,presenta una tendencia al crecimiento y desarrollo urbano con poca o nula planificación que busque proteger dicho recurso natural. Esta microcuenca enfrenta el reto de conservar su biodiversidad para sustentar los valores ecológicos. (Piedra et al, 2016).
Es por esta razón que en los últimos años el río Pirro ha sido objeto de diversos estudios científicos que demuestran el alto grado de contaminación en el agua y el suelo producto de la actividad humana ,viendo como sus afluentes se ven influenciados por el vertedero de residuos líquidos ordinarios, domiciliarios y comerciales, así como al vertedero de desechos sólidos ordinarios en diferentes partes de la microcuenca, los cuales finalmente terminan en el cauce principal del río (Romero et al, 2011).
Investigaciones sobre la evaluación de metales pesados en el río Pirro realizadas por Herrera, Rodríguez, Coto, Salgado & Borbón (2012), indican que el aumento en la concentración de los mismos en los lechos sedimentarios del río y los mecanismos de sorción-desorción y precipitación-disolución, provocan la resuspensión de estos en la columna de agua, dejándolos biodisponibles para la vegetación acuática. Algunos metales encontrados en el río Pirro entre 1150 y 1100 m.s.n.m. son: arsénico, manganeso, mercurio, zinc, cobre, aluminio, plomo y cromo, respectivamente. La incorporación de metales pesados a las cadenas tróficas, su magnificación y bioacumulación en los organismos, representan una problemática para los ecosistemas acuáticos, debido a su dificultad de eliminación.
Los crustáceos cladóceros Daphnia pulex y Daphnia magna son frecuentemente utilizados como indicadores para bioensayos de toxicidad, su utilidad se debe a que tienen un ciclo de vida corto y a sus capacidades reproductivas; tienen una fase en que las hembras son partenogenéticas, y otra fase en que se da la reproducción sexual (Hiruta, Nishita & Tochinai, 2010).
La adaptación de Daphnia pulex a una baja concentración de O2 disuelto (OD) en el agua, así como la tolerancia y capacidad de reproducción bajo un amplio rango de parámetros físico-químicos como pH (6.5 - 8.7), temperatura (10 - 30°C) y salinidad (0,78 a 24 g/L), hacen que sea un organismo apto para bioensayos acuáticos de toxicidad. (Macedo et al,., 1986), (Davis & Ozburn, 1969), (Burns, 1969; Dufresne & Hebert, 1998), (Vignatti et al., 2012).
Según LeBlanc (1980) los estudios de toxicidad realizados con D. pulex han determinado la susceptibilidad de la especie a los diferentes contaminantes prioritarios y compuestos químicos presentes en el agua, como hidrocarburos aromáticos (Trucco, Engelhardt & Stacey, 1983), anestésicos (Hermens et al., 1984), variaciones en la composición iónica (Mount et al., 1997), antibióticos veterinarios (Wollenberger, Halling & Kusk, 2000), iones de cobre (Cu+2) (Schamphelaere & Janssen ,2002), numerosos compuestos químicos (Lilius, Hästbacka & Isomaa, 1995; Martins, Teles, & Vasconcelos, 2007), así como metales (Ponyton et al., 2007), iones de Zinc (Zn+2) (Clifford & McGeer, 2009) y lixiviados provenientes de residuos sólidos urbanos (Rivera, Barba & Torres, 2013), cuyo origen es presumiblemente antropogénico.
La toxicidad en D. pulex está relacionada con la bioacumulación de sustancias que causan una inhibición enzimática y disrupción de la membrana citoplasmática en los tejidos del organismo. (Pretti et al., 2009).
Debido a que D. pulex es un organismo adaptado a un amplio rango de parámetros y a la vez susceptible a numerosos compuestos y elementos químicos, así como contaminantes, el objetivo de la presente investigación fue comparar la tolerancia de esta especie al agua del río Pirro en tres diferentes puntos de muestreo, con respecto a un Control, en un lapso de 24 y 48 horas. Este trabajo busca por tanto comprobar el nivel de contaminación del rÍo Pirro por medio de un ensayo este organismo.
Hipotesis nula: No hay diferencia entre la cantidad de sobrevivientes a las 24 y 48 horas en el bioensayo de toxicidad del agua del río Pirro con respecto al control.
Hipotesis alternativa: Si hay diferencia entre la cantidad de sobrevivientes a las 24 y 48 horas en el bioensayo de toxicidad del agua del río Pirro con respecto al control.
Materiales y métodos
Se realizó un muestreo de tres puntos del río Pirro en la provincia de Heredia, Costa Rica. Estos puntos fueron seleccionados bajo el supuesto de baja contaminación (San Rafael), moderada contaminación (Heredia) y alta contaminación (Guararí) en orden decreciente de altitud (Cuadro 1), siendo San Rafael la naciente del río. Se utilizó el medio en el que estaban las dafnias del laboratorio húmedo de la Universidad Nacional (UNA) como punto de Control.
Cuadro 1 Altitud de los tres puntos de muestreo.
Las muestras fueron recolectadas directamente en el cauce del río y se midió la temperatura, el oxígeno disuelto (OD) y el pH de cada una como parámetros físico-químicos, para esto se utilizaron un sensor de oxígeno “Vernier”, un termómetro y tiras para la medición de pH. Las mediciones se realizaron in situ con el fin de que los parámetros no cambiarán durante el viaje hacia la universidad. Una vez recolectada la muestra se procedió a realizar filtrados con un embudo de vidrio y papel filtro para disminuir la cantidad de materia orgánica disuelta. Los filtrados se depositaron en un beaker el cual se lavaba después de cada filtrado para evitar la contaminación cruzada entre cada tratamiento. Una vez realizada la filtración, el agua se añadía en una placa para bioensayos la cual contenía en orden, agua de control, agua de San Rafael, agua de Heredia y agua de Guararí. Las dafnias fueron donadas por el laboratorio húmedo de la Universidad Nacional de Costa Rica y se colocaron 10 en cada uno de los pozos de la placa de bioensayo, con una pipeta pasteur. Se colocó la placa con las dafnias en el laboratorio húmedo para que estas estuvieran en las mismas condiciones de las cuales provenían, se realizaron dos conteos a las 24 y 48 horas posteriores al inóculo en la placa.
Una vez realizados los conteos se procedieron a realizar Análisis de Varianzas (ANDEVA) y se analizó la normalidad de sus residuos con una prueba de Shapiro y realizarón pruebas Post-hoc
Resultados
Los resultados obtenidos de los parámetros físicoquímicos para los diferentes puntos de muestreo en la cuenca del río Pirro, se muestran en el cuadro 2. El pH en todos los puntos de muestreo presenta un rango de entre 6 y 7, la temperatura se encuentra entre 20-27 °C, mientras que el Oxigeno disuelto presenta valores entre los 14-19 mg/L. Al no presentar gran diferencia entre el rango de cada parámetro medido estos valores no se tomaron en cuenta para los análisis estadisticos.
Cuadro 2. Parámetros físico-químicos tomados en los diferentes puntos de muestreo
A continuación se demuestran todos los análisis estadísticos realizados en esta investigación comenzando con una prueba de varianza para las 24 horas para contrastar la cantidad de dafnias muertas contra los sitios de muestreo.
Cantidad_24h_aov<-aov(Cantidad ~ Sitio, data= Daphnia[Daphnia$Tiempo=="24h",])Se realizó la prueba de normalidad para el análisis de varianza de la cantidad de dafnias a las 24h.
shapiro.test(Cantidad_24h_aov$residuals)##
## Shapiro-Wilk normality test
##
## data: Cantidad_24h_aov$residuals
## W = 0.92626, p-value = 0.08043summary.lm(Cantidad_24h_aov)##
## Call:
## aov(formula = Cantidad ~ Sitio, data = Daphnia[Daphnia$Tiempo ==
## "24h", ])
##
## Residuals:
## Min 1Q Median 3Q Max
## -1.1667 -0.3333 -0.1667 0.2917 1.1667
##
## Coefficients:
## Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)
## (Intercept) 8.8333 0.2555 34.573 < 2e-16 ***
## SitioGuararí -1.6667 0.3613 -4.613 0.000168 ***
## SitioHeredia -1.6667 0.3613 -4.613 0.000168 ***
## SitioSanRafael -0.5000 0.3613 -1.384 0.181671
## ---
## Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
##
## Residual standard error: 0.6258 on 20 degrees of freedom
## Multiple R-squared: 0.6202, Adjusted R-squared: 0.5632
## F-statistic: 10.89 on 3 and 20 DF, p-value: 0.0001869Debido a que los métodos fueron paramétricos, se decidió realizar una prueba de Bartlett para determinar la homocedasticidad.
##
## Bartlett test of homogeneity of variances
##
## data: Cantidad by Sitio
## Bartlett's K-squared = 2.3082, df = 3, p-value = 0.511Se procedió una prueba de Tukey ya que los residuos eran normales, balanceados y homocedásticos.
C.Cantidad_24h_aov<-TukeyHSD(Cantidad_24h_aov)
C.Cantidad_24h_aov$Sitio## diff lwr upr p adj
## Guararí-Control -1.666667 -2.6779915 -0.6553418 0.0008941779
## Heredia-Control -1.666667 -2.6779915 -0.6553418 0.0008941779
## SanRafael-Control -0.500000 -1.5113248 0.5113248 0.5233720489
## Heredia-Guararí 0.000000 -1.0113248 1.0113248 1.0000000000
## SanRafael-Guararí 1.166667 0.1553418 2.1779915 0.0201843450
## SanRafael-Heredia 1.166667 0.1553418 2.1779915 0.0201843450La media de supervivencia para los puntos de Heredia y Guararí fueron bajas, siendo de 7 en ambas.Los puntos San Rafael y Control presentan una mayor media de supervivencia, siendo de control 9 y San Rafael 8 respectivamente, como se muestra en la figura 1.
Se encontró que la supervivencia a las 24 horas, fue mayor en el Control, seguido por San Rafael, UNA y Guararí de manera significativa (F=10.89; gl=3,20; p<0.05). Así mismo se realizó una comparación no planeada Tukey HSD, y se encontraron diferencias significativas entre Guararí-Control (p<0.05), Heredia-Control (p<0.05), Guararí-San Rafael (p<0.05), pero no entre Control-San Rafael (p>0.05), UNA-Guararí (p>0.05).
## Warning: package 'ggplot2' was built under R version 3.4.4
Figura 1: Cantidad de dafnias sobrevivientes en cada tratamiento a las 24 horas
Posterior a esto se implementó una prueba de análisis de varianza para el segundo conteo de dafnias muertas para las 48 horas.
Cantidad_48h_aov<-aov(Cantidad ~ Sitio, data= Daphnia[Daphnia$Tiempo=="48h",])
Cantidad_48h_aov## Call:
## aov(formula = Cantidad ~ Sitio, data = Daphnia[Daphnia$Tiempo ==
## "48h", ])
##
## Terms:
## Sitio Residuals
## Sum of Squares 162.33333 35.66667
## Deg. of Freedom 3 20
##
## Residual standard error: 1.335415
## Estimated effects may be unbalancedSe realizó una prueba de normalidad a los residuos para comprobar si los métodos son paramétricos.
shapiro.test(Cantidad_48h_aov$residuals)##
## Shapiro-Wilk normality test
##
## data: Cantidad_48h_aov$residuals
## W = 0.90148, p-value = 0.02314Debido a que los métodos resultaron ser no paramétricos, se hizo un test de Kruskal-Wallis.
Cantidad_48h_kw<-kruskal.test(Cantidad ~ Sitio, data= Daphnia[Daphnia$Tiempo=="48h",])
Cantidad_48h_kw##
## Kruskal-Wallis rank sum test
##
## data: Cantidad by Sitio
## Kruskal-Wallis chi-squared = 17.569, df = 3, p-value = 0.0005396Como los métodos no fueron paramétricos y los datos balanceados, se decidió hacer una prueba de Levene.
## Levene's Test for Homogeneity of Variance (center = median)
## Df F value Pr(>F)
## group 3 0.6824 0.5731
## 20Por lo tanto los datos presentaron homocedasticidad.
Para observar las diferencias y saber si fueron significativas se aplicó una prueba Post-hoc con ajuste de Bonferroni.
Comparacion<-pairwise.wilcox.test(Daphnia$Cantidad[Daphnia$Tiempo=="48h"], Daphnia$Sitio[Daphnia$Tiempo=="48h"], p.adj = "bonferroni", exact= F)
Comparacion<-ifelse(Comparacion$p.value<0.05, "Diferente", "Igual")
Comparacion## Control Guararí Heredia
## Guararí "Diferente" NA NA
## Heredia "Diferente" "Igual" NA
## SanRafael "Igual" "Diferente" "Diferente"La media de supervivencia para los puntos de Heredia y Guararí fueron bajas, siendo Heredia el que presenta una media menor de aproximadamente 1 individuo. Los puntos San Rafael y Control presentan una mayor media de supervivencia, siendo de 7 y 6.5 respectivamente, como se muestra en la Fig. 2.
Para la prueba de 48 horas se aplicó una prueba de Kruskal-Wallis en donde se evaluó que la supervivencia de las 48 horas, fue mayor en San Rafael, seguido por Control, Guararí y UNA de manera no significativa (KW= 17,57; gl=3; p<0.05). Así mismo se realizó una comparación planeada de los resultados balanceados utilizando Bonferroni, y se encontraron diferencias significativas entre Heredia-Control (p<0.05), Control-Guararí (p<0.05), Guararí-San Rafael (p<0.05), pero no hubo diferencias significativas entre Control-San Rafael (p>0.05), Heredia-Guararí (p>0.05).
Figura. 2: Cantidad de dafnias sobrevivientes en cada tratamiento a las 48 horas.
Se ejecutó una ultima prueba de análisis de varianza para determinar la tasa de mortalidad de las dafnias a las 24 y 48 horas en relación con el sitio de muestreo.
Mortalidad_aov<-aov(Mortalidad ~ Sitio, data= Mortalidad)Se procedió a revisar la normalidad de los residuos.
shapiro.test(Mortalidad_aov$residuals)##
## Shapiro-Wilk normality test
##
## data: Mortalidad_aov$residuals
## W = 0.91605, p-value = 0.0478Al realizar la normalidad, se procedió a ejecutar una prueba de Kruskal-Wallis
Mortalidad_kw<-kruskal.test(Mortalidad ~ Sitio, data= Mortalidad)
Mortalidad_kw##
## Kruskal-Wallis rank sum test
##
## data: Mortalidad by Sitio
## Kruskal-Wallis chi-squared = 15.781, df = 3, p-value = 0.001257Finalmente se ejecutó una comparación entre mortalidad y sitio de muestreo debido a que los resultados fueron balanceados.
Comparacion<-pairwise.wilcox.test(Mortalidad$Mortalidad, Mortalidad$Sitio, p.adj = "bonferroni", exact= F)
Comparacion<-ifelse(Comparacion$p.value<0.05, "Diferente", "Igual")
Comparacion## Control Guararí Heredia
## Guararí "Diferente" NA NA
## Heredia "Igual" "Igual" NA
## SanRafael "Igual" "Diferente" "Igual"Se contabilizaron las dafnias sobrevivientes en el laboratorio a partir de las 24 horas hasta las 48 horas. Se puede observar en el cuadro 3 que el resultado que se obtuvo fue de mayor supervivencia en las muestras de Control y San Rafael, mientras que en Heredia y Guararí se obtuvo un número menor de individuos sobrevivientes.
El promedio de individuos sobrevivientes por tratamiento en las 24 y 48 horas posteriores al inóculo se muestra en el cuadro 3. A las 48 horas se realizó otro conteo de daphnias, la supervivencia en San Rafael y Guararí presentó un aumento en comparación con el conteo de 24 horas, los puntos Heredia y Control en cambio mostraron un descenso en la supervivencia.
El gráfico de mortalidad de daphnias se resume en la figura 3, en esta se muestra el índice de mortalidad entre las 24 y 48 horas así como la comparación entre las daphnias vivas durante dichos conteos, se puede observar como la cantidad de dafnias sobrevivientes depende de los puntos muestreados. se observa como Guararí y Heredia no presentan diferencias significativas entre sí al igual que los puntos San Rafael y Control. sin embargo sí se observan diferencias entre ambos grupos
Fig. 3. Tasa de mortalidad de D. pulex en cuatro localidades de Heredia (A). Cantidad de Dafnias a las 24h (B) y 48h (C). Letras iguales no diferencia estadisticamente significativa entre los sitios, post-hoc Bonferorri (p>0.05; A y C) y Tukey (p>0.05; B).
Discución
La Dafnia es un organismo ampliamente adaptable a las bajas concentraciones de oxígeno disuelto, pH y temperatura. Los resultados de los parámetros físico-químicos muestran valores que se encuentran en su rango de tolerancia (Davis & Ozburn, 1969; Burns, 1969; Dufresne & Hebert, 1998; Macedo, Rosas, Solís & Vázquez, 1986), así mismo, se observa como la mortalidad no es dependiente de los parámetros físico-químicos medidos en este experimento.
Los parámetros de OD, temperatura y pH obtenidos en el agua del río Pirro fueron muy similares para los tres puntos en los que se realizó el muestreo y se presume que estos no influyeron en la supervivencia de D. pulex,ya que los estudios realizados con esta especie demostraron que su adaptación es muy variable en estos aspectos (Macedo et al, 1986; Vignatii et al, 2012).
Sin embargo, D. pulex sí se ve afectada por sustancias de origen antropogénico, como lo son los detergentes, los alcoholes, los derivados de hidrocarburos aromáticos, agroquímicos, lixiviados, agroquímicos, desechos sólidos entre otras sustancias, las cuales podrían estar presentes en el cauce del río Pirro (Trucco et al, 1983; Lilius et al, 1995; Martins et al, 2007; Rivera et al, 2013) La tasa de mortalidad a las 24 horas es la esperada, donde el Control y San Rafael presentan una supervivencia más elevada, Heredia y Guararí en cambio presentan mortalidad elevada en ese orden, se estima que lo anterior se debe a la acumulación de desechos y sustancias que aumentan conforme avanza la microcuenca del Pirro; el ingreso de aguas residuales hace que se acumulen contaminantes con el descenso del río, por lo que se presume que estos factores contribuyeron a la mortalidad de D. pulex mayormente en los sitios de muestreo de menor altitud (Heredia y Guararí). El conteo a las 48 horas presentó cambios en el patrón de mortalidad en los distintos sitios; la menor mortalidad se mostró en San Rafael fenómeno que puede ser explicado por la presencia de nutrientes provenientes de la muestra ambiental.
Concluciones
Como D. pulex soporta amplios rangos de temperatura, salinidad, pH y bajo OD en el agua y los parámetros físico-químicos obtenidos en los tres sitios de muestreo fueron similares, se concluye que dichos parámetros no influyeron en la mortalidad. Debido a que la contaminación del río aumenta con el descenso de la altitud, porque los contaminantes disueltos se acumulan al bajar, la mortalidad de D. pulex fue significativamente mayor en los puntos de muestreo de menor altitud, tanto a las 24 como a las 48 horas de haber realizado el inóculo.
Se recomienda realizar más repeticiones de este ensayo con el fin de obtener una mayor cantidad de datos que permitan un análisis más significativo. Es recomendable usar juveniles de la especie para evitar fenómenos de reproducción y depredación que afecten los conteos posteriores. Además para que el hambre no sea un factor incidente en la mortalidad, se recomienda alimentar a las dafnias al menos una vez al dia.
Referencias
Asghari, S., Johari, S. A., Lee, J. H., Kim, Y. S., Jeon, Y. B., Choi, H. J., … Yu, I. J. (2012). Toxicity of various silver nanoparticles compared to silver ions in Daphnia magna. Journal of Nanobiotechnology, 10(1), 14. doi:10.1186/1477-3155-10-14
Barahona, M. A., Banegas, M. M., Borjas, J. E. M. G., & Van, K. B. (2016). Toxicidad Aguda (24h) de Daphnia magna (Strauss) Expuesta a Tres Metales; Cadmio (Cd) Cobre (Cu) y Zinc (Zn), Tanto en su Forma Individual como en Mezcla. CENTRO DE ESTUDIOS Y CONTROL DE CONTAMINANTES (CESCCO), 69.
Bermúdez, T., Piedra, L., Alvarado, V.,Castillo, M., Rodríguez, A. (2015) Tecnologías para la rehabilitación en una microcuenca urbana.
Burns, C. W. (1969). Relation between filtering rate, temperature, and body size in four species of Daphnia. Limnology and Oceanography, 14(5), 693-700.
Castro, L. P., Vargas, M. R., & Campos, L. O. (2017). Las cuencas urbanas y su fauna: el caso del río Pirro, Heredia, Costa Rica. Biocenosis, 31(1-2).
Clifford, M., & McGeer, J. C. (2009). Development of a biotic ligand model for the acute toxicity of zinc to Daphnia pulex in soft waters. Aquatic Toxicology, 91(1), 26–32. doi:10.1016/j.aquatox.2008.09.016
Davis, P., & Ozburn, G. W. (1969). The pH tolerance of Daphnia pulex (Leydig, emend., Richard). Canadian Journal of Zoology, 47(6), 1173-1175.
Dufresne, F., & Hebert, P. D. (1998). Temperature-related differences in life-history characteristics between diploid and polyploid clones of the Daphnia pulex complex. Ecoscience, 5(4), 433-437.
Hermens, J. L. M., Canton, H., Janssen, P., & Jong, R. D. (1984). Quantitative structure-activity relationships and toxicity studies of mixtures of chemicals with anaesthetic potency: Acute lethal and sublethal toxicity to Daphnia magna. Aquatic Toxicology, 5(2), 143-154.
Herrera-Núñez, J., Rodríguez-Corrales, J., Coto-Campos, J. M., Salgado-Silva, V., & Borbón-Alpízar, H. (2013). Evaluación de metales pesados en los sedimentos superficiales del río Pirro. Revista Tecnología en Marcha, 26(1), 27-36.
Hiruta, C., Nishida, C., & Tochinai, S. (2010). Abortive meiosis in the oogenesis of parthenogenetic Daphnia pulex. Chromosome Research, 18(7), 833-840.
Kim, J.-W., Chang, K.-H., Isobe, T., & Tanabe, S. (2011). Acute toxicity of benzotriazole ultraviolet stabilizers on freshwater crustacean (Daphnia pulex). The Journal of Toxicological Sciences, 36(2), 247–251. doi:10.2131/jts.36.247
Kozlova, T., Wood, C. M., & McGeer, J. C. (2009). The effect of water chemistry on the acute toxicity of nickel to the cladoceran Daphnia pulex and the development of a biotic ligand model. Aquatic Toxicology, 91(3), 221–228. doi:10.1016/j.aquatox.2008.11.005
Lallana, V. H., & Lallana, M. (2014). Manual de prácticas de fisiología vegetal. Córdoba, Argentina: Eduner.
LeBlanc, G. A. (1980). Acute toxicity of priority pollutants to water flea (Daphnia magna). Bulletin of environmental contamination and toxicology, 24(1), 684-691.
Lilius, H., Hästbacka, T., & Isomaa, B. (1995). A comparison of the toxicity of 30 reference chemicals to Daphnia magna and Daphnia pulex. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal, 14(12), 2085-2088.
Mangas-Ramı́rez, E., Sarma, S. S. S., & Nandini, S. (2002). Combined effects of algal (Chlorella vulgaris) density and ammonia concentration on the population dynamics of Ceriodaphnia dubia and Moina macrocopa (Cladocera). Ecotoxicology and Environmental Safety, 51(3), 216-222.
Martins, J., Teles, L. O., & Vasconcelos, V. (2007). Assays with Daphnia magna and Danio rerio as alert systems in aquatic toxicology. Environment International, 33(3), 414-425.
Mount, D. R., Gulley, D. D., Hockett, J. R., Garrison, T. D., & Evans, J. M. (1997). Statistical models to predict the toxicity of major ions to Ceriodaphnia dubia, Daphnia magna and Pimephales promelas (fathead minnows). Environmental Toxicology and Chemistry, 16(10), 2009-2019.
Pretti, C., Chiappe, C., Baldetti, I., Brunini, S., Monni, G., Intorre, L. (2009). Acute toxicity of ionic liquids for three freshwater organisms: Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna and Danio rerio.
Romero, M., Piedra, L., Villalobos, R., Marin, R., Nuñez, F. (2011).EVALUACIÓN ECOLÓGICA RÁPIDA DE UN ECOSISTEMA URBANO: EL CASO DE LA MICROCUENCA DEL RÍO PIRRO, HEREDIA, COSTA RICA
Richman, S. (1958). The transformation of energy by Daphnia pulex. Ecological Monographs, 28(3), 273-291.
Rivera-Laguna, E., Barba-Ho, L., & Torres-Lozada, P. (2013). Determinación de la toxicidad de lixiviados provenientes de residuos sólidos urbanos mediante indicadores biológicos. Afinidad, 70(563).
Schamphelaere, K. A., & Janssen, C. R. (2002). A biotic ligand model predicting acute copper toxicity for Daphnia magna: the effects of calcium, magnesium, sodium, potassium, and pH. Environmental science & technology, 36(1), 48-54.
Trucco, R. G., Engelhardt, F. R., & Stacey, B. (1983). Toxicity, accumulation and clearance of aromatic hydrocarbons in Daphnia pulex. Environmental Pollution Series A, Ecological and Biological, 31(3), 191-202.
Vignatti, M. A., Paggi, J.C., Echaniz, S.A., Cabrera, G.C. (2012). Tolerancia a la salinidad de dos cladóceros halófilos autóctonos: Daphnia menucoensis y Moina eugeniae (Artropoda, Crustacea).
Wollenberger, L., Halling-Sørensen, B., & Kusk, K. O. (2000). Acute and chronic toxicity of veterinary antibiotics to Daphnia magna. Chemosphere, 40(7), 723-730.
Zein, M. A., McElmurry, S. P., Kashian, D. R., Savolainen, P. T., & Pitts, D. K. (2013). Optical bioassay for measuring sublethal toxicity of insecticides in Daphnia pulex. Environmental Toxicology and Chemistry, 33(1), 144–151. doi:10.1002/etc.2404
.