Resumen:

Un liquen está formado por una simbiosis hongo-alga. Exhiben alteraciones determinadas en respuesta a las transformaciones de su medio, por ende, son considerados buenos bioindicadores de contaminación. Utilizando cuadrantes, confeccionados con tubos de PVC, se tomaron 60 muestras fotográficas en el Monte de la Cruz, cerca de un ambiente perturbado (una carretera) y de uno sin perturbar (un río). Utilizando el programa Image J se obtuvieron las áreas de los líquenes a partir de las muestras obtenidas previamente. Con estas imágenes, también se estimó el conteo de líquenes de acuerdo con su morfología y su sustrato. Con las áreas obtenidas se aplicó una prueba T-Student, para determinar diferencias significativas en la distribución liquénica, entre la carretera y el río. Se generó una tabla de contingencia 2x2 con los datos de la morfología y del sustrato y posteriormente se aplicó una prueba de Chi-cuadrado para analizar el nivel de significancia de los datos de acuerdo al sustrato, mientras que para el análisis de morfotipo se aplicó una prueba de Fisher, para comprobar su dependencia al ambiente, debido a que presentaba 20% de valores menores a cinco en la tabla de contingencia. Con los resultados obtenidos, se llegó a la conclusión de que, bajo este diseño experimental, en el Monte de la Cruz no es viable utilizar los líquenes como bioindicadores por factores como su competencia con musgos, humedad del ambiente, entre otros.

Palabras clave: Bioindicador, río, carretera, perturbación ambiental, liquen, Monte de la Cruz

Introducción:

Un líquen está compuesto por una estrecha relación simbiótica entre un alga y un hongo (Wydrzycka, 2009) que resulta en un organismo estable con funciones fisiológicas específicas (Hawksworth, Iturriaga y Crespo, 2005). Estos se caracterizan por la ausencia de raíz o sistemas de conducción (Hawksworth, Iturriaga y Crespo, 2005), así mismo, son organismos autótrofos de crecimiento lento, de amplia distribución y capacidad de desarrollarse en sustratos inertes u orgánicos (Wydrzycka, 2009).

En esta relación, el micobionte le suministra al alga sales inorgánicas, agua y protección ante la alta radiación solar, a su vez que el componente algal aporta carbohidratos obtenidos durante la fotosíntesis (Wydrzycka, 2009). El tejido fúngico rodea al alga dando origen a diversas estructuras morfológicas que son usadas para su clasificación: en forma de arbusto o ramificación (fruticuloso), con escamas pequeñas que se extienden en la columna de sujeción(escamoso), adheridos o fusionados al sustrato(crustáceo) o con crecimiento laminoso en forma de roseta (folioso) (Lijteroff, Lima y Prieri, 2009).

El ambiente en el cual se desarrollan presentan condiciones adversas para ambos componentes, y su capacidad de sobrevivir está ligada a mecanismos fisiológicos para perder y absorber agua . Durante intensidades de luz elevadas, el hongo se torna, crujiente y frágil, otorgándole una capa protectora al alga y deteniendo la fotosíntesis, la cual es retomada durante periodos de humedad (Wydrzycka, 2009). Esta propiedad de absorber agua y otras sustancias asociadas en la lluvia o neblina, permiten identificar las características químicas de su medio. Los efectos inmediatos de estas sustancias se manifiestan en la coloración, distribución y frecuencia (Hawksworth, Iturriaga y Crespo, 2005) lo que les confieren cualidades de bioindicador.

Un bioindicador es organismos que presenta características físicas y biológicas estrechamente relacionadas con el ambiente en el cual se desarrolla, de modo que exhibe alteraciones determinadas en respuesta a las transformaciones que experimente su medio (Hawksworth, Iturriaga y Crespo, 2005).

Estos cambios pueden ser expresados a manera cuantitativa o cualitativa, de forma que se pueden realizar análisis y pruebas estadísticas para cuantificar las magnitudes de un determinado fenómeno o hecho (Hawksworth, Iturriaga y Crespo, 2005). Los líquenes fueron usados por primera vez en siglo XIX como indicador de la presencia de dióxido de azufre durante la industrialización, actualmente son empleados como detectores de sustancias como el amoniaco, algunos fluoruros, metales, hidrocarburos y lluvia ácida ( Lijteroff, Lima y Prieri, 2009).

Los líquenes presentan características específicas que son esenciales y favorables para realizar trabajos sobre la perturbación ambiental, entre las cuales destacan: su amplia distribución y adaptación, desde climas extremos, bosques húmedos o secos, hasta ambientes urbanos. La facilidad de crecer en distintos sustratos (hojas, piedras, troncos o paredes), la ausencia de una cutícula protectora que impida la absorción o selección de sustancias, y su naturaleza perenne, que facilita su muestreo y seguimiento durante cualquier periodo del año o estación (Barreno y Pérez-Ortega, 2003).

Objetivos:

Objetivo General

Comparar la frecuencia, el sustrato y el morfotipo liquénico para la comprobación de su aplicación como bioindicador de la perturbación del bosque en el Monte de la Cruz.

Objetivos Especificos

Determinar la frecuencia, el sustrato y el morfotipo liquénico basados en un ambiente perturbado y natural.

Identificar las diferencias entre un ambiente perturbado y natural.

Materiales y métodos:

Área de estudio:

La toma de los datos se desarrolló en el Monte de la Cruz, en el cantón de San Rafael de Heredia a ocho kilómetros de la zona central. El área presenta un bosque tropical húmedo predominante, con una temperatura promedio entre los 15 y 22°C y una humedad relativa de 85 a 99% que incrementa durante los meses de octubre y noviembre. Se localiza a 1862 m.s.n.m, y presenta una flora y fauna característica de climas húmedos en donde destacan en su mayoría helechos y hongos (Municipalidad de San Rafael, 2018). Presenta calles asfaltadas en las principales vías de tránsito y zonas más cercanas a la montaña conservan caminos de piedra. El río que atraviesa la zona (río Las Vueltas) es de bajo caudal y se reduce durante la temporada seca. Se destaca la actividad ganadera y lechera a pequeña escala y el establecimiento de un parque recreativo. Actualmente el Monte de la Cruz se encuentra administrado por la Municipalidad de San Rafael de Heredia (Municipalidad de San Rafael, 2018).

Selección del área de muestreo:

Se definieron dos áreas de estudio de 2700m^2 cada una, ambas con distintos niveles de perturbación: la primera se ubicó en los alrededores de un ambiente no perturbado (el río Las Vueltas) en zonas alejadas de la urbanización o terrenos destinados al pastoreo. La segunda área de muestreo,la perturbada, se realizó en un terreno cercado colindante a una carretera de piedra. Para cada área se establecieron 30 cuadrantes de 2.25 m^2 cada uno, la selección de los mismos se desarrolló de forma aleatoria, lanzado un objeto de tamaño y coloración visible en dirección arbitraria a lo largo del terreno. Consecuentemente, se descartaron aquellos cuadrantes repetidos o cercanos a un cuadrante anterior. Para medir el área de cada uno, se utilizaron dos marcos armables elaborados con tubos de PVC y codos.

Toma de muestras y cuantificación:

Se procedió a tomar fotografías de los líquenes encontrados en cada cuadrante independientemente de su morfotipo y su sustrato: troncos, piedras, hojas o suelo; junto con una regla u objeto de tamaño conocido. Para aquellos encontrados en los árboles, se consideraron únicamente los ubicados a una altura inferior al metro y medio. Las fotografías se tomaron con cámaras de celular y se rotularon según el área de estudio y número de cuadrante. Se utilizó posteriormente el software ImageJ para medir el área superficial de los líquenes, independientemente de su morfotipo y sustrato, que se encontraron en las fotos tomadas, con el fin de determinar un equivalente de milímetros cuadrados de líquen por cuadrante. Por otra parte, dichos líquenes fueron contabilizados por colonias y se clasificaron según su morfología y tipo de sustrato.

Análisis de los datos:

Los datos obtendidos se procesaron a través del lenguaje de programación R, aplicando dos test de hipótesis tomando en cuenta si los datos fueron simétricos o no. Para la clasificación de las colonias liquénicas según sustrato y morfotipo se aplicó la prueba de Chi-cuadrado, y en aquellos datos que presentaron valores esperados menores a cinco se utilizó la prueba de Fisher. El análisis de las áreas (mm^2) registradas con el software ImageJ en ambas zonas de estudio se realizó con una transformación de los datos empleando la fórmula Ln(1+Área Liquénica), posteriormente, la prueba de normalidad de Shapiro-Wilkinson, y basados en la simetría de los datos, estos se analizaron finalmente a través de la prueba de T student.

Resultados:

Durante el trabajo de campo, se tomaron fotografías de los líquenes por cuadrante y se clasificaron los mismos según su morfotipo y el sustrato sobre el cual se encontraban y si se encontraban en la zona perturbada o la no perturbada. Se encontraron cuatro morfotipos: crustáceo, fructicoso, folioso y algodonoso, y tres sustratos: madera, rocas y hojas. Posteriormente, se midió el área liquénica independiente del morfotipo y el sustrato (tomando en cuenta solo si se encontraban alrededor del área sin perturbar o la perturbada) con ImageJ obteniendo los siguientes resultados:

c(245.7778,  2707.1111,  1204.3333, 13871.1111,   789.0100,   392.4444,  1596.8889,
   400.0000,   133.3333,  6332.0000,   118.6667,   177.7778,   311.1111,   311.1111,
  1540.1778,  1392.8889,   590.6667,   260.0000,   285.7778,   790.6667,  613.7778,
  3210.2222,  761.7778,   196.4444,  2135.1111,   481.7778,  431.5556,  1396.0000,   444.4444,   140.8889)->Area_perturbada
c(4584.9,  3607.9, 20405.0, 11308.3,   790.7, 19741.7,  5101.5,    85.0,  4120.6, 2711.7,1174.0,   600.0,  1100.0,   448.0,  1038.0,   291.0,    78.0,   289.0,   249.0,42.0,900.0, 15984.0, 14200.0,   593.0,  1729.0,  9276.0,  2092.0,   500.0,    66.0 ,  847.2)->Area_sin_perturbar
data.frame(Area_perturbada,Area_sin_perturbar)
##    Area_perturbada Area_sin_perturbar
## 1         245.7778             4584.9
## 2        2707.1111             3607.9
## 3        1204.3333            20405.0
## 4       13871.1111            11308.3
## 5         789.0100              790.7
## 6         392.4444            19741.7
## 7        1596.8889             5101.5
## 8         400.0000               85.0
## 9         133.3333             4120.6
## 10       6332.0000             2711.7
## 11        118.6667             1174.0
## 12        177.7778              600.0
## 13        311.1111             1100.0
## 14        311.1111              448.0
## 15       1540.1778             1038.0
## 16       1392.8889              291.0
## 17        590.6667               78.0
## 18        260.0000              289.0
## 19        285.7778              249.0
## 20        790.6667               42.0
## 21        613.7778              900.0
## 22       3210.2222            15984.0
## 23        761.7778            14200.0
## 24        196.4444              593.0
## 25       2135.1111             1729.0
## 26        481.7778             9276.0
## 27        431.5556             2092.0
## 28       1396.0000              500.0
## 29        444.4444               66.0
## 30        140.8889              847.2

Aplicando el test de normalidad de Shapiro-Wilkinson, los valores de p-value del área liquénica alrededor del área perturbada y la no perturbada dan como resultado 4.327e-09 y 1.117e-06 respectivamente, lo cual indica que los datos son asimétricos.

shapiro.test(Area_sin_perturbar)
## 
##  Shapiro-Wilk normality test
## 
## data:  Area_sin_perturbar
## W = 0.68992, p-value = 1.117e-06
shapiro.test(Area_perturbada)
## 
##  Shapiro-Wilk normality test
## 
## data:  Area_perturbada
## W = 0.49116, p-value = 4.327e-09

Con el fin de normalizar los datos, se aplicó una transformación de los mismos utilizando la fórmula Ln(1+AL) siendo AL valor del área liquénica (mm^2). A continuación se muestran los datos ya transformados:

c(5.508488, 7.904007, 7.094511, 9.537636, 6.672046, 5.974940, 7.376439, 5.993961, 4.900324,
 8.753529, 4.784710, 5.186144, 5.743359, 5.743359, 7.340302, 7.239853, 6.382943, 5.564520,
 5.658708 ,6.674140, 6.421261, 8.074407, 6.636967, 5.285457, 7.666742, 6.179556, 6.069711,
 7.242082, 6.099073, 4.955044)->Area_perturbada_2
c(8.430742, 8.191158, 9.923584, 9.333381, 6.674183, 9.890539, 8.537486, 4.454347, 8.323997,
   7.905700, 7.069023, 6.398595, 7.003974, 6.107023, 6.946014, 5.676754, 4.369448, 5.669881,
   5.521461, 3.761200, 6.803505, 9.679406, 9.561068, 6.386879, 7.455877, 9.135293, 7.646354,
   6.216606, 4.204693, 6.743116)->Area_sin_perturbar_2 
data.frame(Area_perturbada, Area_sin_perturbar_2)
##    Area_perturbada Area_sin_perturbar_2
## 1         245.7778             8.430742
## 2        2707.1111             8.191158
## 3        1204.3333             9.923584
## 4       13871.1111             9.333381
## 5         789.0100             6.674183
## 6         392.4444             9.890539
## 7        1596.8889             8.537486
## 8         400.0000             4.454347
## 9         133.3333             8.323997
## 10       6332.0000             7.905700
## 11        118.6667             7.069023
## 12        177.7778             6.398595
## 13        311.1111             7.003974
## 14        311.1111             6.107023
## 15       1540.1778             6.946014
## 16       1392.8889             5.676754
## 17        590.6667             4.369448
## 18        260.0000             5.669881
## 19        285.7778             5.521461
## 20        790.6667             3.761200
## 21        613.7778             6.803505
## 22       3210.2222             9.679406
## 23        761.7778             9.561068
## 24        196.4444             6.386879
## 25       2135.1111             7.455877
## 26        481.7778             9.135293
## 27        431.5556             7.646354
## 28       1396.0000             6.216606
## 29        444.4444             4.204693
## 30        140.8889             6.743116

Posteriormente, al aplicarle el test de normalidad al área liquénica ya transformada de la carretera y el río, estos tienen un p-value de 0.2583 y 0.4183 respectivamente, lo cual, gracias a que dichos datos son simétricos, se puede realizar la prueba paramétrica de T Student, la cual da un valor de p-value de 0.09851, lo cual significa que, a un nivel de significancia del 95%, se acepta la hipótesis nula, es decir, no hay una diferencia significativa en la distribución del área liquénica alrededor de la carretera y del río.

shapiro.test(Area_perturbada_2)
## 
##  Shapiro-Wilk normality test
## 
## data:  Area_perturbada_2
## W = 0.95695, p-value = 0.2583
shapiro.test(Area_sin_perturbar_2)
## 
##  Shapiro-Wilk normality test
## 
## data:  Area_sin_perturbar_2
## W = 0.96524, p-value = 0.4183
var.test(Area_perturbada_2,Area_sin_perturbar_2)
## 
##  F test to compare two variances
## 
## data:  Area_perturbada_2 and Area_sin_perturbar_2
## F = 0.43772, num df = 29, denom df = 29, p-value = 0.02959
## alternative hypothesis: true ratio of variances is not equal to 1
## 95 percent confidence interval:
##  0.2083382 0.9196432
## sample estimates:
## ratio of variances 
##          0.4377178
t.test(Area_perturbada_2, Area_sin_perturbar_2, var.equal = F)
## 
##  Welch Two Sample t-test
## 
## data:  Area_perturbada_2 and Area_sin_perturbar_2
## t = -1.6833, df = 50.306, p-value = 0.09851
## alternative hypothesis: true difference in means is not equal to 0
## 95 percent confidence interval:
##  -1.415032  0.124561
## sample estimates:
## mean of x mean of y 
##  6.488807  7.134043

En el presente gráfico (Figura 1) se observa que no hay una variación muy grande entre las medianas de los datos en ambos ambientes, demostrando visualmente lo obtenido por la prueba de T Student.

data.frame(Area_perturbada_2, Area_sin_perturbar_2)->ln
ln
##    Area_perturbada_2 Area_sin_perturbar_2
## 1           5.508488             8.430742
## 2           7.904007             8.191158
## 3           7.094511             9.923584
## 4           9.537636             9.333381
## 5           6.672046             6.674183
## 6           5.974940             9.890539
## 7           7.376439             8.537486
## 8           5.993961             4.454347
## 9           4.900324             8.323997
## 10          8.753529             7.905700
## 11          4.784710             7.069023
## 12          5.186144             6.398595
## 13          5.743359             7.003974
## 14          5.743359             6.107023
## 15          7.340302             6.946014
## 16          7.239853             5.676754
## 17          6.382943             4.369448
## 18          5.564520             5.669881
## 19          5.658708             5.521461
## 20          6.674140             3.761200
## 21          6.421261             6.803505
## 22          8.074407             9.679406
## 23          6.636967             9.561068
## 24          5.285457             6.386879
## 25          7.666742             7.455877
## 26          6.179556             9.135293
## 27          6.069711             7.646354
## 28          7.242082             6.216606
## 29          6.099073             4.204693
## 30          4.955044             6.743116
boxplot(ln, main="Área liquénica transformada cerca el río y la carretera", col=c("green", "blue"), ylab="(Ln(1+mm^(2))", xlab="Figura 1")

Por otro lado, al clasificar las colonias de líquenes según su sustrato, estos presentaron valores esperados mayores a cinco, por lo que se aplicó una prueba de Chi-cuadrado donde se evaluó el sustrato respecto al ambientesin perturbar y el perturbado. Se encontró una diferencia significativa entre ambas poblaciones, rechazando la hipotesis nula al 95% de confianza, ya que se observa que el p-value presenta un valor de 2.2e-16.En la Figura 2, se observa que el sustrato preferido por los líquenes en ambas zonas correspondió la madera, siendo esta preferencia mayor en la zona perturbada que en la zona sin perturbar.

sustrato<-data.frame("Área sin perturbar"=c(515,60,56),"Area perturbada"=c(661,8,12))
row.names(sustrato)<-c("Madera","Roca","Hoja")
names(sustrato)<-c("Área sin perturbar", "Area perturbada")
sustrato
##        Área sin perturbar Area perturbada
## Madera                515             661
## Roca                   60               8
## Hoja                   56              12
chisq.test(sustrato)$expected
##        Área sin perturbar Area perturbada
## Madera          565.59146       610.40854
## Roca             32.70427        35.29573
## Hoja             32.70427        35.29573
chisq.test(sustrato)
## 
##  Pearson's Chi-squared test
## 
## data:  sustrato
## X-squared = 84.578, df = 2, p-value < 2.2e-16

Se aplicó la prueba de Fisher para los datos correspondientes a la clasificación de colonias liquénicas según su morfología en el area sin perturbar y la perturbada dado a que el 25% de los datos esperados contenían valores menores a 5. Se encontraron diferencias significativas entre ambas poblaciones a un 95% de confianza (p<0.05), (Fig. 4) reflejando que la morfología liquénica es dependiente de su localización en donde el liquen de morfología crustáceo el más influyente en ambos sectores, pero mayoritariamente en el area sin perturbar.

morfo<-data.frame("Área sin perturbar"=c(571,24,17,4),"Área perturbada"=c(317,63,79,1))
row.names(morfo)<-c("Crustáceo","Folioso","Fructiculoso", "Algodonoso")
data.frame(morfo)->ee
ee
##              Área.sin.perturbar Área.perturbada
## Crustáceo                   571             317
## Folioso                      24              63
## Fructiculoso                 17              79
## Algodonoso                    4               1
fisher.test(ee)
## 
##  Fisher's Exact Test for Count Data
## 
## data:  ee
## p-value < 2.2e-16
## alternative hypothesis: two.sided
summary(fisher.test(morfo))
##             Length Class  Mode     
## p.value     1      -none- numeric  
## alternative 1      -none- character
## method      1      -none- character
## data.name   1      -none- character
chisq.test(morfo, simulate.p.value = T)
## 
##  Pearson's Chi-squared test with simulated p-value (based on 2000
##  replicates)
## 
## data:  morfo
## X-squared = 111.71, df = NA, p-value = 0.0004998

Discusión:

Partiendo de los resultados obtenidos, se comprueba que no hay una diferencia significativa en la distribución del área liquénica entre la zona perturbada (Carretera) y la zona no perturbada (Río). Dicha indiferencia entre ambos ambientes se debe a la capacidad de los líquenes de soportar ambientes distintos, ya que según lo menciona Itatí Ferraro (s.f) los líquenes pueden soportar factores ambientales adversos y a su vez distribuirse en condiciones de hábitat muy diversificadas gracias a sus capacidades de supervivencia como lo son su capacidad de aguantar desecación y su condición autótrofa.

En cuanto a la clasificación de líquenes según su sustrato, se observa que la cantidad de colonias de líquenes que se encontraban sobre madera en el área sin perturbar fue menor que en la perturbada, ya que éste como factor discriminante en la colonización influye por medio de sus características físicas y químicas, por lo tanto permite una mayor retención de agua por más días (Barreno y Pérez-Ortega, 2003). El color es otro factor determinante, ya que los sustratos oscuros como las rocas se calientan mucho más que los claros, como las madera, incidiendo sobre la temperatura y la retención de agua de los talos (Barreno y Pérez-Ortega, 2003).

Los líquenes pueden ser clasificados con respecto a la calidad del ambiente que estos pueden soportar, para esto se agrupan según su tipo morfológico. Si el ambiente presenta alta perturbación humana no se encontrará ningún tipo de liquen; si la perturbación es media se hallarán líquenes crustáceos; si hay baja perturbación dominarán los foliosos; si el ambiente no es perturbado, fruticulosos; esto se debe al comportamiento hídrico de cada morfotipo, presentando el fructiculoso mayor dependencia al agua (Rivera-Ortíz, 2008).

Los datos obtenidos por Hawksworth, Iturriaga y Crespo, 2005, sugieren que en la zona perturbada los líquenes del tipo crustáceo fueron los que se encontraron en mayor cantidad y la relación entre la cantidad de líquenes foliosos y fructiculosos varió, siendo estos últimos los que se hallaron en mayor número, esto se debe a que la humedad relativa del río y las actividades humanas también afectan esta cantidad. Sin embargo, según los datos obtenidos en el Monte de la Cruz, la mayor cantidad de líquenes encontrados en la zona sin perturbar (el río) fue del tipo crustáceo, luego folioso, fructiculoso y algodonoso, esto se debe a que ese lugar presenta una mayor humedad y los sustratos son ocupados mayoritariamente por los musgos antes que los líquenes, compitiendo entre ellos por el espacio. La dominancia de los líquenes crustáceos se debe a que las características de estos los condicionan para ser más resistentes, lo que les permite mantenerse vivos ante la invasión de los musgos (Delgadillo y Cárdenas, 2009).

Conclusiones:

De acuerdo al diseño experimental desarrollado, la utilización del área liquénica como parámetro para comprobar la capacidad de un liquen como bioindicador en el Monte de la Cruz no es un factor determinante o concluyente al no haber una diferencia significativa en la distribución total de los líquenes entre la zona perturbada y la sin perturbar.

Debido a lo anterior y en relación con las observaciones del modelo experimental y el manejo de los datos, se concluye que una mejor administración y segmentación de los mismos, hubiesen permitido un mayor número de análisis y resultados de más peso. Entre ellos se destaca la posibilidad de analizar el área liquénica por sustrato encontrado o por tipo morfológico.

Así mismo se encontró que el área de estudio en los alrededores del río estuvo afectada por variables no consideradas durante el diseño experimental, tales como la humedad, y la competividad entre musgos y líquenes resultante de esta. Por lo anterior, se recomienda realizar tomas o muestreos en secciones del bosque con un nivel de humedad menos influyente.

Finalmente, es importante considerar las diferencias del sustrato liquénico en las zonas de estudio como posible factor influyente en la expresión de estos como bioindicadores, ya que se encontraron diferencias entre la composición del sustrato rocoso en río (roca lisa y sedimentaria) y carretera (porosa y de composición volcánica).

Referencias:

Barreno, E., y Pérez-Ortega, S. (2003). Liquenes de la Reserva Natural Integral de Muniellos, Asturias. Madrid, España: KRK Ediciones.

Delgadillo, C., y Cárdenas, A. (2009). Musgos y otras briofitas de importancia en la sucesión primaria. Biodiversidad del ecosistema del Pedregal de San Ángel, 101-105.

Hawksworth, L. D., Iturriaga, T. y Crespo, A. (2005). Líquenes como bioindicadores inmediatos contaminación y cambios medio-ambientales en los trópicos. Rev. Iberoam. Micol.,22 (1), 71-82.

Itatí Ferraro, L. (s.f.). Líquenes. Obtenido de Hipertextos del Área de la Biología: http://www.biologia.edu.ar/fungi/liquenes.htm

Lijteroff, R., Lima, L. y Prieri, B. (2009). Uso de líquenes como bioindicadores de contaminación atmosférica en la ciudad de San Luis, Argentina. Rev. Int. Contam. Ambient, 25 (2), 111, 120.

Municipalidad de San Rafael. (2018) Municipalidad San Rafael. Heredia: Municipalidad de San Rafael. Recuperado de: https://www.munisrh.go.cr/monte-de-la-cruz/

Rivera-Ortíz, E. I. (2008). Estudio de líquenes como indicadores de los niveles de contaminación en el pueblo de Guayama, Puerto Rico (Tesis de maestría). Universidad del Turabo, Gurabo, Puerto Rico.

Wydrzycka, U. (2009). Botánica general. Heredia, Costa Rica: EUNA.