CL50

MÓDULO ECOTOXICOLOGÍA: CÁLCULO DE LAS CONCENTRACIONES LETALES 50 (CL50) DEL NITRITO A 96h EN DOS ESPECIES

Especies: invertebrados de agua dulce (Eulimnogammarus toletanus y Polycelis felina) procedentes de poblaciones naturales

Fecha:

Ciencias Ambientales, Universidad de Alcalá

Profesor: Álvaro Alonso Fernández (Dpto. Ciencias de la Vida)

Lugar: Aula Huérmeces (Facultad de CC.AA)

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El objetivo de la práctica es calcular la CL50 (concentración letal 50) (o LC50) a 96 horas de dos especies de invertebrados acuáticos y comparar qué especie es más sensible para un tóxico determinado. Para ello realizaremos un modelo matemático que relaciona la concentración de tóxico con la mortalidad. La concentración de tóxico (variable independiente) y la respuesta de una población (mortalidad=variable dependiente) serán las variables del modelo. La técnica estadística a emplear será un modelo no-lineal de regresión para una curva concentración-respuesta.

La tarea a realizar se detalla AL FINAL DEL TEXTO, pero antes hay que hacer una pequeña explicación y ver los datos que vamos a emplear para los cálculos. Hay que ser muy cuidadoso y ordenado al trabajaR con R, de lo contrario la práctica no os saldrá bien.

¿Cómo ajustamos la mortalidad al incremento del tóxico?

La relación que existe entre una variable independiente (la concentración de tóxico) y una variable dependiente (la respuesta=mortalidad) para una especie y un tiempo de exposición al tóxico (normalmente 48 o 96 horas) se puede modelizar matemáticamente. Para ello, la respuesta acumulada de los organismos (mortalidad acumulada) (eje Y) se enfrenta a la CONCENTRACIÓN DE TÓXICO (eje X). El resultado es una curva con forma de S, tras ajustar esos datos a una curva podemos interpolar para conocer que concentración de tóxico causa el 50% de mortalidad (CL50). La CL50 (para un tiempo dado, normalmente 48 o 96 horas) es la concentración letal 50, es decir la concentración de tóxico necesaria para causar la muerte del 50% de la población de estudio en un tiempo determinado (la DL50 sería la dosis letal 50, y se utiliza cuando conocemos la cantidad de tóxico que hay en el interior del organismo) .

La CL50 (o CE50 cuando el parámetro que se estudia es diferente a la mortalidad) es útil en ecotoxicología para:

-Comparar sensibilidades entre diferentes especies para un mismo tóxico.

-Comparar toxicidad de varios compuestos para una misma especie.

-En la Evaluación del Riesgo Ambiental (ERA) de los tóxicos.

-Es un parámetro que se suele utilizar para exposiciones cortas (=agudas o a corto plazo), y por tanto suele emplear concentraciones relativamente altas de tóxico.

Para calcular la CL50 es necesario realizar un modelo de regresión no-lineal concentración-respuesta (existan otras alternativas matemáticas para ello, hoy solo veremos una).

Si se representa la mortalidad acumulada en % (en el eje Y) y la concentración en el eje X (log-ln trasformado) de los datos lo que obtenemos es una respuesta de tipo sigmoidal:

En teoría, la respuesta de nuestra población a un tóxico se debe ajustar a una distribución normal, presentando la mayoría de los individuos una sensibilidad intermedia, y unos pocos individuos con sensibilidades extremas (muy tolerantes o muy sensibles). La respuesta sería del tipo:

Debido a que el modelo matemático no-lineal (como cualquier otro) tiene asociado un grado de incertidumbre, el valor de CL50 tiene unos límites de confianza, que normalmente se expresan al 95%, es decir hay un 95% de probabilidades que nuestro valor de CL50 se encuentre dentro de ese intervalo. De tal manera que la CL50 para una especie concreta se expresa de la forma:

CL50 96 horas = X (X1-X2)

Siendo X el valor de CL50 predicho por el modelo, y X1 y X2 el límite inferior (lower limit) y superior (upper limit), respectivamente. Si tenemos dos valores de CL50 con sus límites para dos especies podemos comparar estadísticamente que especie es más sensible a un tóxico concreto. Para ello, si los límites de confianza entre las dos especies no salapan se puede afirmar que una de las especies es más sensible que la otra con una p de 0.05 (es decir hay un 5% de probabilidades que esa afirmación sea incorrecta). También se puede aplicar un test estadístico en el caso de que solapen.

En ecotoxicología la CL50 nos informa de la sensibilidad de la especie a un compuesto concreto, lo cual nos puede ayudar a determinar criterios de calidad (límites máximos de contaminante que pueden estar presentes en el ecosistema a corto plazo). Un método para determinar un criterio de calidad es basarse en la especie más sensible del ecosistema, por lo tanto el resto de especies no se verán afectadas si se respeta ese límite. También, si en un proceso industrial tenemos la posibilidad de utilizar dos compuestos químicos podemos elegir aquel que presente la más baja toxicidad (en base a valores de CL50).

Cálculo de las CL50 a 96 horas y sus límites de confianza al 95% para dos especies

Las dos especies son de agua dulce. La primera es una anfípodo (Eulimnogammarus toletanus) y la segunda es una planaria (Polycelis felina). Para cada especie se situaron 10 individuos en pocillos de 100 ml de volumen y se emplearon 5 concentraciones crecientes de nitrito (NO2-) (=tratamientos tóxico) y un control (sin nitrito) (=tratamiento control). Para cada especie y tratamiento se emplearon tres pocillos (=tres réplicas por tratamiento). La siguiente figura muestra un esquema del diseño experimental de los bioensayos:

Esquema del diseño experimental empleado

Cada día se renovaron las soluciones de tóxico y del agua de los controles para evitar la oxidación del nitrito a nitrato. Con ello también se evita la acumulación de desechos procedentes de los animales (por tanto es un bioensayo estático con renovación diaria). Cada 24 horas se cuantifica el número de muertos y se van retirando de cada pocillo.

Tras 96 horas se cuantificó la mortalidad acumulada en cada una de las réplicas (=pocillos), contando el número de organismos muertos totales. Los resultados obtenidos fueron (PF=Polycelis felina, ET=Eulimnogammarus toletanus):

Datos brutos del experimento. Mortalidad acumulada a 96 horas para las dos especies de invertebrados

Utilizando el programa R hay que calcular las CL50 a 96 horas para las dos especies con sus respectivos límites de confianza al 95%.

Pasos a seguir

Lo primero que debemos hacer es abrir RStudio, cargar (install.packages("nombre")) y activar los paquetes (library("nombre")) requeridos:

library(drc)

## Warning: package 'drc' was built under R version 3.5.3

## Loading required package: MASS

## 
## 'drc' has been loaded.

## Please cite R and 'drc' if used for a publication,

## for references type 'citation()' and 'citation('drc')'.

## 
## Attaching package: 'drc'

## The following objects are masked from 'package:stats':
## 
##     gaussian, getInitial

Después hay que generar el fichero con nuestros datos de trabajo. Incluir una columna con la concentración, otra con el total de animales utilizados en cada pocillo, otra con los que mueren y otra con el porcentaje de respuesta. Esto hay que hacerlo en Excel y guardar el archivo como CSV delimitado por comas. Ojo que tenemos datos para dos especies.

Cargamos el fichero con nuestros datos en RStudio. Para ello fijamos directorio de trabajo con setwd:

setwd(dir = "C:/nuestracarpeta1/nuestracarpeta2/")

Leemos el fichero y su estructura. Comprobar que las variables son correctas, sin errores, valores perdidos, etc.

misdatos<-read.table("misdatos.csv", sep = ";", header = TRUE, dec = ".")

misdatos

str(misdatos)

A continuación representar una figura con el porcentaje de respuesta frente a la concentración para cada una de las especies:

plot(concentrationsp1, percentagesp1,xlab="concentration(mg N-NO2/L)", ylab="Mortality(%)",cex=1.3,col="red",pch=16, main="Polycelis felina")

Observar las dos representaciones gráficas ¿Qué forma tienen?

Ahora toca realizar el modelo, debe hacerse uno para cada una de las especies:

modelo1<-drm(percentagesp1 ~ concentrationsp1, data=misdatos, fct=LL.4(fixed=c(NA,0,100,NA),

names =c("slope","lower limit","upper limit","LC50")))

Y lo representamos gráficamente:

plot(modelo1,xlab="concentration(mg N-NO2/L)", ylab="Mortality(%)",cex=1.3, col="red",

pch=16, main="Polycelis felina")

Repetimos el procedimeinto para la otra especie.

Una vez que hemos visto como responde cada especie al incremento de concentración toca conocer los valores de CL50, para ello pedimos a R que nos haga un resumen de cada uno de los modelos:

summary(modelo1)

¿Cuál es el valor de CL50 para cada una de las especies?¿Los valores que obtienes tienen sentido?¿Se corresponde el resultado con lo que pensabas al principio?

Ahora calculamos los límites de confianza al 95% para cada una de las especies de la siguiente forma:

confint(modelo1)

¿Cuáles son los límites de confianza al 95% de la CL50 de cada una de las especies?

¿Hay diferencias estadísticas entre esos valores de CL50? ¿Cuál de las dos especies es más sensible al nitrito? ¿Alguna posible explicación para ello?

¿QUÉ TIENE QUE CONTENER VUESTRO SCRIPT?

1.GUARDAR VUESTRO TRABAJO EN UN FICHERO CL50-GR-NÚMERO

2.INCLUIR EN EL ENCABEZADO VUESTROS NOMBRES Y APELLIDOS

3.TODOS LOS PASOS EXPLICADOS Y BIEN RAZONADOS. RESPONDE A TODAS LAS PREGUNTAS PLANTEADAS EN LA PRÁCTICA

4.ENVIA EL SCRIPT A MI CORREO DEL LA UAH ANTES DE FINALIZAR LA PRÁCTICA