Resumen

En el presente trabajo, se realizó el análisis sobre el potencial bioremediador de dos especies de microalgas del género Chlorella sp. y Chlamydomona sp., esto surge como respuesta a la creciente contaminación que se ha presentado por la presencia de metales pesados en los compuestos lixiviados generados como desechos, que afectan tanto en suelos como en aguas. Los iones metálicos derivados principalmente de fuentes antropogénicas representan un grave problema para la salud humana debida a la contaminación del agua, el suelo y el aire asociados a su toxicidad, bioacumulación y sin propiedades de biodegradabilidad. Para el presente estudio, se cultivaron ambas especies de microalgas en medio de cultivo BBM estéril, por otro lado, se contó con una muestra de lixiviados procedentes de la Escuela de Química. Se procedió a inocular ambas cepas en tubos de ensayo estériles, variando la concentración de lixiviados al 50%, 25% y 5%. Por medio de microscopia electrónica, se realizó el conteo respectivo del crecimiento de microalgas, los resultados obtenidos se analizaron por medio del programa Rstudio y se presentaron por medio de gráficos realizados con el mismo. Entre las conclusiones obtenidas, se observó que ambas especies de microalgas presentaban potencial biorremediador; sin embargo, la microalga Chlorella vulgaris, obtuvo una mayor concentración celular en presencia de lixiviados al 50%, por lo que se ultima que es la especie más apta a utilizar para la biorremediación.

Palabras clave: Lixiviados, Biorremediación, Rstudio, Metales pesados.

Objetivo General: Analizar los procesos químicos que ocurren en la naturaleza y la importancia de un manejo racional de estos, para favorecer las condiciones de sostenibilidad ambiental.

Objetivos Específicos:

1. INTRODUCCIÓN

Thieman y Palladino (2010), actualmente “muchos equipos trabajan para investigar el uso de organismos acuáticos como bio-indicadores para detectar bajas concentraciones de contaminantes y toxinas en vías fluviales” (p.257). Estos se han asociado directamente con la calidad del agua. Según Herbas, Rivero y Gonzales (2006), un organismo indicador se “refiere a especies seleccionadas por su sensibilidad o tolerancia o varios parámetros” (p.3).

El principio de bioindicación se resume como la capacidad del microorganismo para soportar los efectos ocasionados por el elemento perturbante, es decir que muestre algún tipo de respuesta compensatoria o tolerante.

Los indicadores biológicos son importantes porque permiten determinar la calidad del agua e implementar acciones sobre la recuperación son variadas. Cairns y Dickson 1971, citado por Vázquez, Castro, González, Pérez y Castro, 2006, p.42, mencionan algunas de las ventajas:

El uso de los bioindicadores, es considerado una buena herramienta para determinar la contaminación de un río, lago o cualquier cuerpo de agua. Thieman y Palladino (2010, p. 257-258), afirman lo siguiente:
La contaminación por metales pesados de las aguas marinas es el resultado de muchos procesos de fabricación industrial. Y como solución al problema, los científicos han aislado (…) algas unicelulares con presencia de metalotioneínas. Además estas especies prosperan en aguas contaminadas con cadmio y otros metales pesados, en los que limpian literalmente el cadmio del entorno y, a continuación, degradan los metales tóxicos y los descompone en subproductos menos dañinos.

Así mismo, la bioindicación por medio de la presencia de ciertas microalgas evidencia que un cuerpo de agua puede estar contaminado. Por lo tanto, la resistencia de ciertos microorganismos a ambientes contaminados, ha despertado el interés de muchos científicos, tal y como lo es hoy en día, el estudio de la Biorremediación.

La biorremediación asistida con microalgas resulta particularmente atractiva debido a su capacidad fotosintética, ya que les permite convertir la energía solar en biomasa. La misma incorpora nutrientes como nitrógeno y fósforo causantes de la eutroficación. Los procesos que utilizan microalgas y cianobacterias, están enfocados principalmente a la remoción de nutrientes y de metales pesados presentes en las aguas residuales. No obstante, también se encuentra bien documentada su capacidad para remover elementos radioactivos a partir de efluentes (Ferrera, Rojas, Poggi, Alarcón, y Cañizares, 2006).

Siguiendo en la misma línea, los contaminantes orgánicos en el medio acuático son biodegradados por diversos microorganismos, incluyendo algas, las cuales han demostrado que son capaces de biotransformar y biodegradar contaminantes aromáticos comúnmente encontrados en aguas naturales y residuales. Las microalgas y cianobacterias proveen de carbono reducido y nitrógeno a la microbiota presente en los ecosistemas acuáticos, lo que incrementa el potencial de degradación y eliminación de contaminantes. (Semple, Cain, y Schmidt, 1999).

Las tendencias de investigación realizadas por Ferrera, et al. 2006, afirman que la biorremediación de aguas contaminadas con hidrocarburo o metales pesados utilizando microalgas y cianobacterias, se enfocan principalmente a:

2. SECCIÓN EXPERIMENTAL:

En ésta investigación, se trabajó con microalgas como bioindicadores, debido a su fácil acceso y su relación con la eutrofización. Se ha demostrado que es muy común encontrar en aguas residuales microalgas del género Chlorella vulgaris y Chlamydomona sp., esto se debe a que estas son capaces de soportar altas concentraciones de nutrientes contenidos en dichas aguas. Además, tienen un metabolismo muy activo y son resistentes a cambios ambientales que les permiten sobrevivir en este tipo de ambiente. Por lo que se ha hecho posible el uso de esta microalga como bioindicador y biorremediador (Delgadillo, 2014).

2.1 MATERIALES Y EQUIPO:

2.2 REACTIVOS:

3. ORGANIZACIÓN METODOLÓGICA:

Se podrá acceder a las muestras de microalgas del Laboratorio de Biotecnología en Microalgas, con la profesora y supervisora del laboratorio Narcy Villalobos Sandí (Biotecnóloga). Para realizar el conteo, un estudiante del presente grupo irá cada día a revisar las muestras y verificar mediante el microscopio electrónico el número de microalgas vivas presentes en la Placa de Neubauer.

3.1 PROCEDIMIENTO:

Previamente a la recolección de la muestra de lixiviados, se solicitó al encargado del laboratorio de Gestión de Desechos de la Escuela de Química, una muestra de aguas contaminadas con metales pesados de los laboratorios de Química (docencia). Posteriormente se realizó los cálculos para determinar la concentración de la disolución obtenida al diluir el cien por ciento de los lixiviados colectados con el agua, para 100mL. En este caso se trabajó con diluciones al 50%, 25% y 5% de lixiviado.

En un segundo momento, se preparó un litro del medio de cultivo BBM para algas verdes, y se alistaron dos Erlenmeyers, con el medio de cultivo, seguidamente se colocó un tapón con un sistema de bombeo de aire al Erlenmeyer. Se aseguró que la longitud del tubo de bombeo llegue hasta el medio. Con el sistema listo y esterilizado, se realizó el inóculo con las microalgas: Chlorella vulgaris y Clamydomona sp., y se colocaron en los Erlenmeyer, posteriormente, se colocaron bajo una fuente de luz constante. Los sistemas de bombeos fueron sometidos a un motor de aire. El tiempo de crecimiento fue ejecutado en una semana.

Para el tercer momento, se trabajó con una gradilla con los tubos estériles, y se llevó acabo el procedimiento en la cámara de flujo laminar. Por medio de una pipeta se dispensó 8 mL del medio de cultivo BBM en cada tubo, y mediante una micropipeta se agregó 1mL de las sepas que se pusieron a crecer en los Erlenmeyer. Después se agregó a 10 tubos la cepa 1 y a los faltantes 10 tubos la cepa 2. Seguidamente se repitió esto mismo con la cepa 2.

La observación, inició el lunes, con el fin de poder observar el proceso durante 5 días. Por medio del microscopio electrónico, se colocó una gota (0.1 microlitros) de la muestra en la placa de Neubauer y se situó un cubre objetos, seguidamente se enfocó el microscopio de manera que se pueda realizar el conteo respectivo en las celdas.

Con los resultados obtenidos, se prosiguió a introducir los datos a excel, con el fin de introducirlos a “Rstudio”. Con este programa, se facilitó a realizar un gráfico con el paquete de ggplot2 y car, para generar un boxplot, y de esta forma se pudo comparar cuál fue la especie de microalga que mejor respondió al tratamiento a partir de las tres variables, tales como: el tiempo, concentración de células por mililitro y concentración de metales. Los comandos utilizados en “Rstudio” fueron los siguientes:

ggplot(aes(y=Conc, x=Dia), data=Datos) ->gg
gg+xlab("Día") + ylab("Concentración") -> gg
gg+facet_grid(Alga~Tratamiento, scales="free")->gg
gg+geom_boxplot(aes(fill=Dia))->gg
gg+theme_bw()->gg
gg <- gg + theme(strip.background=element_rect(fill="darkgray"))
gg <- gg + theme(strip.text=element_text(color="white", face="bold"))
gg

Variables a Medir con los resultados obtenidos.

La mortalidad de estos microorganismos a ciertas condiciones de estrés, como es el caso de los lixiviados y metales pesados, genera una condición, que encierra el objetivo más importante y es conocer el número de microorganismos vivos según los diferentes tratamientos aplicados con metales pesados.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Gracias a la actividad humana, ha aumentado la entrada de contaminantes químicos y biológicos, en particular el de fosforo y nitrógeno, a los cuerpos de agua a través de prácticas agrícolas, urbanización, e industrialización. Estas actividades han demostrado causar eutrofización a los sistemas acuíferos. Por esta razón, muchos científicos hoy en día enfocan su atención a encontrar soluciones a estas problemáticas, tal y como los son los estudios recientes que han demostrado que las microalgas tienen el potencial de remover contaminantes de aguas lixiviadas. Estos contaminantes pueden ser incorporados a la biomasa celular del alga, y subsecuentemente removidos de las aguas residuales. Este tratamiento, mediante una combinación de absorción de nutrientes, pH elevado, y una concentración de oxígeno disuelto, puede ofrecer una técnicas de tratamiento más seguras, baratas, y más eficiente con el ambiente a la hora de remover nutrientes y metales de aguas lixiviadas, que otros tratamientos (Yang y Kunshan, 2003).

Además, las células algales presentan en sus sistemas relativamente grandes áreas de superficie que contienen varios grupos funcionales, entre ellos carboxílico, amino, tio, hidroxo e hidroxi-carboxílico, las cuales interactúan de manera coordinada con iones de metales pesados (Xue, Stumm y Sigg, 1998). Los metales pesados se pueden clasificar en esenciales y no esenciales para el desarrollo de la planta. Y la toxicidad en los organismos vivientes depende de su concentración en el medio.

Por este motivo, se ha realizado la presente investigación para conocer el potencial de biorremediación de ciertas microalgas en presencia de aguas contaminadas con lixiviados. A la luz de la metodología anterior, se obtuvieron los resultados durante 5 días y a continuación se mostrarán mediante la figura 1, el tratamiento de lixiviados que fueron utilizados en las dos especies de microalgas: Chlorella vulgaris y Chlamydomona sp.

Figura 1. Comportamiento de la Chlorella vulgaris y Chlamydomona sp. en presencia de lixiviados en un periodo de 5 días. *Conc: concentración de células/microlitro.

La microalga Chlorella vulgaris es utilizada en el desarrollo de procesos de bioremediación, y este proceso se puede observar en la figura 1, ya que este microorganismo tuvo tasas de concentración celular muy elevadas en presencia de lixiviados al 50%, comparado con los otros dos tratamientos al 5 y 25%, ya que en presencia de metales pesados tienen la facilidad para adaptarse y su acelerar su crecimiento en el medio, también tiene la capacidad de absorber rápidamente nutrientes y CO2, esto genera tasas de crecimiento altas, permitiendo desarrollarse en diferentes ambientes acuáticos. Estudios realizados, han afirmado la capacidad que tiene para degradar contaminantes como fenoles, compuestos aromáticos, colorantes sintéticos y biopolímeros recalcitrantes como la melanoidina (Brennan y Owende, 2010).

Debido a la capacidad de crecimiento de la Chlorella vulgaris en presencia de lixiviados, era de esperarse que esta microalga fuera la que obtuviera la mayor tasa de crecimiento comparada a la Chlamydomona sp, ya que Según Mishell (2017) esta presenta una alta capacidad de remoción de metales pesados, en aguas residuales, ya que posee un área superficial grande y una elevada afinidad de unión de estos elementos. Por este motivo, al poseer una gran masa involucra tener un volumen adecuado, que genera una eficiente separación de cargas dentro del ion metálico, permitiendo una alta polarización dentro del ion que minimiza las repulsiones electrón-electrón. En otras palabras si tenemos cationes isovalentes como el caso de plomo, cadmio y cinc, el ion de mayor peso atómico será mejor y más eficientemente absorbido en comparación a los demás debido a su acidez, y su interacción con el adsorbente será favorecida (Cuizano y Navarro, 2008).

Lo anterior nos relata, que esta microalga posee un excelente coeficiente de biorremediación, pero esto lo logra principalmente, ya que uno de los compuestos que conforman la microalga son los alginatos, son grupos funcionales con elevada densidad electrónica los cuales son responsables de su alta efectividad en la adsorción de metales por el intercambio iónico que se da en la solución con el metal (Cuizano y Navarro, 2008).

En la figura 1, también se muestra un descenso de crecimiento y esto se debe a que presentan la capacidad de acumular e inducir mecanismos de resistencia ante el estrés producido por la exposición a estos metales, generando así mismo una disminución de su bioactividad y por ende de su crecimiento. Los cambios observados en la gráfica por el decrecimiento del alga puede ser resultado de mecanismos de adaptabilidad al estrés inducido por el metal, por lo que se concluye que, aun cuando se presenta inhibición del crecimiento, se producen cambios adaptativos suficientes para mantener el crecimiento y viabilidad celular, por lo que se puede decir que las dos especies pueden ser utilizadas como modelo para el monitoreo de contaminación por metales pesados, aparte de la biorremediación de aguas contaminadas con Lixiviados, con respecto a las condiciones que se presenten (Marcano, Carruyo, Montiel, Morales y Moreno, 2007).

Siguiendo ahora con la microalga Chlamydomona sp. se logró observar que su comportamiento en presencia de lixiviados era normal al 5% donde se puede observar en la figura 1, una tasa de crecimiento y al final una tasa de decrecimiento pero logra estar a la misma concentración celular que al inicio, este comportamiento es normal para esta especie de microlaga, ya que según Kong, Li, Martínez y Ruan (2010), la Chlamydomona sp. al tener altos niveles de nutrientes en su medio de crecimiento podría traer ciertos desordenes en su tasa de crecimiento normal. Según un estudio de (Devriese et al, 2001), el consumo de nitrógeno en Chlamydomona sp. fue afectado principalmente por el metal no esencial (Cd2+), y los metales esenciales (Cu2+, Zn2+).

Siguiendo en la misma línea, los cambios que sufrió Chlamydomona sp, al 5% la concentración de células presentó un ligero aumento y después se mostró constante, indicando una respuesta positiva a los efectos citotóxicos. A una concentración de 25%, la figura muestra un aumento de células constante hasta el día cuatro, donde decrece pero después aumenta el día cinco. Según Howe y Merhcant (1992), el proceso de desintoxicación de metales pesados consta de dos pasos. El primero es la activación de fitoquelatina sintasa (péptido quelante de metales) resultado del aumento de concentración intracelular de los metales pesados del lixiviado. El segundo paso, es la quelación de los metales por las fitoquatinas recién sintetizadas. Este segundo paso, es lo que se presume está relacionado directamente con la tolerancia de las algas al lixiviado. Esto por, al unirse los metales con relativamente alta afinidad, las fitoquantinas previenen reacciones tóxicas entre los metales pesados y macromoléculas esenciales al funcionamiento de las células (ej: enzimas, lípidos, ácidos nucleicos). Este segundo paso puede ser los que ocurrió en la concentración de 25%, las células estaban sufriendo un proceso de adaptación a las concentraciones más altas de lixiviado, y aumentando su tolerancia.
La concentración del 50%, disminuyó drásticamente comparando a la Chlorella vulgaris, mostrando una menos tolerancia a los metales pesados. En un estudio realizado por (Nishikawa et al, 2003), observaron cambios en el aumento de gránulos de almidón y vacuolas, pero reducción de las mitocondrias cuando estos fueron expuestos a metales pesados. La deterioración rápida de mitocondria causó la acumulación de gránulos de almidón. En consecuencia, las actividades respiratorias fueron dañadas causando dentro de la mitocondria, la acumulación de almidón resultando una desorganización en los cloroplastos. El estudio anterior, demuestra que esto pudo haber sucedido cuando el efecto tóxico potencial aumenta, ya que la microalga es incapaz de tener una tasa de recuperación, por ejemplo cuando la Chlamydomona sp. se sometió a la concentración de 50%, se denotó la fase de crecimiento y de muerte celular.

Por esta razón, encontrar un tipo de microalga adecuado que pueda soportar el nivel de estrés de concentraciones altas de metales y nutrientes, es la clave para el tratamiento de lixiviados. La optimización de las concentraciones del lixiviado es crucial para la remoción de nutrientes y producción máxima de biomasa. En la presente investigación se denotó que la especie de microalga que mejor respondió a concentraciones altas de los metales presentes en los lixiviados de la Escuela de Química, fue la Chlorella Vulgaris al tener, una tasa de crecimiento de 397.5 células/ microlitro en comparación con 18.33 ceúlas/microlitro de Chlamydomona sp. Si se quisiese realizar un proceso de purificación con los lixiviados que son desechados de los laboratorios de docencia, se propondría utilizar la Chlorella vulgaris como especie biorremediadora, ya que respondió a tasas de metales concentrados al 50% presentes en los lixiviados.

Conclusiones.

Tras finalizada la investigación, se logró definir correctamente el concepto de bioremediación, así como su importancia para el ambiente debido a que es un método más económico y sin generar gran impacto ambiental, por el contrario, supone un método de eliminación de agentes químicos dañinos.

Se determinó el crecimiento de ambas especies de microalgas en aguas contaminadas, concluyendo que Chlorella vulgaris, es la especie de microalga que presenta el crecimiento más óptimo en agua contaminada al 50% de lixiviados.

A su vez, se puede concluir que el alga Chlamydomona sp. no es apta para altas concentraciones de aguas contaminadas con lixiviados, ya que en una concentración del 50% se observó un gran índice de muerte celular.

Por otro lado, se logró demostrar la capacidad bioremediadora de ambas especies de microalgas; sin embargo, se concluye que la que posee el mayor potencial bioremediador es Chlorella vulgaris, al tener una tasa de resistencia, adaptación y crecimiento exponencial más elevado que la otra especie de microlaga cuando fueron sometidos a altas concentraciones de metales provenientes de los lixiviados.

Referencias Bibliográficas.

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  2. Mishell, A. (2017). Análisis de remoción de cromo por acción de la microalga Chlorella sp. inmovilizada en perlas de alginato (Tesis para optar grado de Ingeniería).Universidad Técnica Salesiana. Quito. Recuperado de http://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/13639/1/UPS-QT11400.pdf
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  10. Devriese, M., Tsakaloudi, V., Garbayo, I., León, R., Vílchez, C. y Vigara, J. (2001). Effect of heavy metals on nitrate assimilation in the eukaryotic microalga Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology and Biochemistry, 39(5), 443-448. doi:10.1016/s0981-9428(01)01257-8
  11. Howe, G. y Merchant, S. (1992). Heavy Metal-Activated Synthesis of Peptides in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology, 98(1), 127-136. doi:10.1104/pp.98.1.127
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Analisis estadistico de los datos en R

library(car)

Se acomodaron todos los datos en Excel y se introdujeron en R usando:

read.csv("C:/Users/melic/Documents/Bioestadistica/Bioestadistica.csv",header = T,sep = ";")->Datos
Datos
##    Conc Tratamiento Dia         Alga
## 1   124           5   1    Chlorella
## 2   117           5   1    Chlorella
## 3   110           5   1    Chlorella
## 4    52          25   1    Chlorella
## 5    90          25   1    Chlorella
## 6   108          25   1    Chlorella
## 7    90          50   1    Chlorella
## 8    32          50   1    Chlorella
## 9   100          50   1    Chlorella
## 10  298           5   2    Chlorella
## 11  259           5   2    Chlorella
## 12  121           5   2    Chlorella
## 13  298          25   2    Chlorella
## 14  147          25   2    Chlorella
## 15  209          25   2    Chlorella
## 16  747          50   2    Chlorella
## 17  510          50   2    Chlorella
## 18  151          50   2    Chlorella
## 19  176           5   3    Chlorella
## 20  188           5   3    Chlorella
## 21  156           5   3    Chlorella
## 22  229          25   3    Chlorella
## 23  256          25   3    Chlorella
## 24  230          25   3    Chlorella
## 25  381          50   3    Chlorella
## 26  279          50   3    Chlorella
## 27  327          50   3    Chlorella
## 28  193           5   4    Chlorella
## 29  150           5   4    Chlorella
## 30  159           5   4    Chlorella
## 31  167          25   4    Chlorella
## 32  189          25   4    Chlorella
## 33  176          25   4    Chlorella
## 34  219          50   4    Chlorella
## 35  392          50   4    Chlorella
## 36  254          50   4    Chlorella
## 37  198           5   5    Chlorella
## 38  181           5   5    Chlorella
## 39  108           5   5    Chlorella
## 40   61          25   5    Chlorella
## 41  215          25   5    Chlorella
## 42  201          25   5    Chlorella
## 43  161          50   5    Chlorella
## 44  200          50   5    Chlorella
## 45  244          50   5    Chlorella
## 46   10           5   1 Chlamydomona
## 47    9           5   1 Chlamydomona
## 48   10           5   1 Chlamydomona
## 49    4          25   1 Chlamydomona
## 50   10          25   1 Chlamydomona
## 51    3          25   1 Chlamydomona
## 52    2          50   1 Chlamydomona
## 53    4          50   1 Chlamydomona
## 54    2          50   1 Chlamydomona
## 55    5           5   2 Chlamydomona
## 56   20           5   2 Chlamydomona
## 57    4           5   2 Chlamydomona
## 58   16          25   2 Chlamydomona
## 59    6          25   2 Chlamydomona
## 60   16          25   2 Chlamydomona
## 61   80          50   2 Chlamydomona
## 62   14          50   2 Chlamydomona
## 63   20          50   2 Chlamydomona
## 64   16           5   3 Chlamydomona
## 65    8           5   3 Chlamydomona
## 66   12           5   3 Chlamydomona
## 67    9          25   3 Chlamydomona
## 68   21          25   3 Chlamydomona
## 69   24          25   3 Chlamydomona
## 70   32          50   3 Chlamydomona
## 71   15          50   3 Chlamydomona
## 72   12          50   3 Chlamydomona
## 73   15           5   4 Chlamydomona
## 74    3           5   4 Chlamydomona
## 75   18           5   4 Chlamydomona
## 76    6          25   4 Chlamydomona
## 77    9          25   4 Chlamydomona
## 78   16          25   4 Chlamydomona
## 79    4          50   4 Chlamydomona
## 80   11          50   4 Chlamydomona
## 81    9          50   4 Chlamydomona
## 82   10           5   5 Chlamydomona
## 83    9           5   5 Chlamydomona
## 84   12           5   5 Chlamydomona
## 85   20          25   5 Chlamydomona
## 86   14          25   5 Chlamydomona
## 87   23          25   5 Chlamydomona
## 88    9          50   5 Chlamydomona
## 89    5          50   5 Chlamydomona
## 90    8          50   5 Chlamydomona

Se comprobaron los datos:

str(Datos)
## 'data.frame':    90 obs. of  4 variables:
##  $ Conc       : int  124 117 110 52 90 108 90 32 100 298 ...
##  $ Tratamiento: int  5 5 5 25 25 25 50 50 50 5 ...
##  $ Dia        : int  1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 ...
##  $ Alga       : Factor w/ 2 levels "Chlamydomona",..: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 ...

Podemos apreciar que los datos no poseen el formato deseado, por lo tanto se designan los factores y los numeros:

as.numeric(Datos$Conc)->Datos$Conc
as.factor(Datos$Tratamiento)->Datos$Tratamiento
as.factor(Datos$Dia)->Datos$Dia

Y se procede a hacer la comprobación

str(Datos)
## 'data.frame':    90 obs. of  4 variables:
##  $ Conc       : num  124 117 110 52 90 108 90 32 100 298 ...
##  $ Tratamiento: Factor w/ 3 levels "5","25","50": 1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 ...
##  $ Dia        : Factor w/ 5 levels "1","2","3","4",..: 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 ...
##  $ Alga       : Factor w/ 2 levels "Chlamydomona",..: 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 ...

Ahora que los datos poseen el formato correcto se realizaron diferentes modelos para el analisis de varianzas:

aov(Conc~Dia*Tratamiento*Alga,data = Datos)->Anova1

aov(Conc~Dia*Alga+Tratamiento,data = Datos)->Anova2

aov(Conc~Dia*Tratamiento+Alga,data = Datos)->Anova3

aov(Conc~Alga*Tratamiento+Dia,data = Datos)->Anova4

aov(Conc~Alga+Tratamiento+Dia,data = Datos)->Anova5

Y se comprobó cual de ellos era el mejor modelo con la prueba de Akaike:

AIC(Anova1,Anova2,Anova3,Anova4,Anova5)
##        df      AIC
## Anova1 31 1035.837
## Anova2 13 1038.330
## Anova3 17 1055.414
## Anova4 11 1045.470
## Anova5  9 1050.297

De lo que concluimos que el modelo mas apto es el Anova1.

Ahora que se posee el modelo se hacen los analisis respectivos

Para la normalidad:

shapiro.test(residuals(Anova1))
## 
##  Shapiro-Wilk normality test
## 
## data:  residuals(Anova1)
## W = 0.65474, p-value = 3.11e-13

Se observa que el modelo no tiene normalidad.

Aplicamos el summary:

summary(Anova1)
##                      Df Sum Sq Mean Sq F value   Pr(>F)    
## Dia                   4 130272   32568   7.412 6.41e-05 ***
## Tratamiento           2  53791   26896   6.121 0.003809 ** 
## Alga                  1 834825  834825 189.991  < 2e-16 ***
## Dia:Tratamiento       8  57491    7186   1.635 0.133829    
## Dia:Alga              4 100437   25109   5.714 0.000578 ***
## Tratamiento:Alga      2  47158   23579   5.366 0.007178 ** 
## Dia:Tratamiento:Alga  8  36061    4508   1.026 0.426921    
## Residuals            60 263642    4394                     
## ---
## Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1

Segun el cual nos damos cuenta que la interaccion Tratamiento:Alga, Dia:Alga son significativos y que todos los tratamientos son igualmente significativos, osea hay diferencias significativas en la variable Conc respecto al tratatiempo, dia y alga.

par(mfrow=c(2,2))
plot(Anova1)

En el grafico 1 se muestra cierta heterocedasticidad sin embargo no se presentan patrones, en el 2 se muestra una clara desviación de la normalidad, en el 3 no se ve un esparcimiento aleatorio de los datos (mas que nada en el 0) lo que indica que hay varianzas diferentes. En el grafico 4 no hay presencia de datos influyentes.

La pruena de Levene nos indica si hay homogenidad de varianzas, se utiliza el arreglo del centro ya que los datos no son parametricos.

leveneTest(Anova1,center=mean)
## Levene's Test for Homogeneity of Variance (center = mean)
##       Df F value    Pr(>F)    
## group 29  5.1443 4.395e-08 ***
##       60                      
## ---
## Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1

Comprobamos que no hay homogenidad.

Para comprobar las interacciones obtenidas por el summary en los tratamientos se realizan interaction plots.

oneway.test(Conc~Tratamiento,data = Datos)
## 
##  One-way analysis of means (not assuming equal variances)
## 
## data:  Conc and Tratamiento
## F = 1.0731, num df = 2.000, denom df = 54.914, p-value = 0.349

Se comprueba que opuesto a lo que se obtivo en el summary, no hay diferencias significativas entre los tratamientos

oneway.test(Conc~Dia, data = Datos)
## 
##  One-way analysis of means (not assuming equal variances)
## 
## data:  Conc and Dia
## F = 3.4388, num df = 4.000, denom df = 39.862, p-value = 0.01661
oneway.test(Conc~Alga,data = Datos)
## 
##  One-way analysis of means (not assuming equal variances)
## 
## data:  Conc and Alga
## F = 106.65, num df = 1.000, denom df = 44.843, p-value = 1.959e-13

Tambien se comprueba que si existen diferencias significativas de la concentración en cada dia y alga.

attach(Datos)

par(mfrow=c(2,2))

interaction.plot(Alga,Dia,Conc)
interaction.plot(Tratamiento,Dia,Conc)
interaction.plot(Alga,Tratamiento,Conc)

Se confirma la interaccion entre la microalga y el tratamiento, asi tambien entre el dia y la microalga.

Se confirma las diferencias de significativas entre los factores y los resultados obtenido con el pairwise.wilcox.test, prueba que se utiliza ya que los datos son no paramétricos.

pairwise.wilcox.test(Conc,Tratamiento,p.adjust.method = "n")
## 
##  Pairwise comparisons using Wilcoxon rank sum test 
## 
## data:  Conc and Tratamiento 
## 
##    5    25  
## 25 0.62 -   
## 50 0.61 0.81
## 
## P value adjustment method: none

No se aprecian diferencias entre ningun tratamiento, lo cual se opone al resultado del summary.

pairwise.wilcox.test(Conc,Dia,p.adjust="n")
## 
##  Pairwise comparisons using Wilcoxon rank sum test 
## 
## data:  Conc and Dia 
## 
##   1     2     3     4    
## 2 0.030 -     -     -    
## 3 0.020 0.912 -     -    
## 4 0.066 0.496 0.296 -    
## 5 0.090 0.457 0.268 0.912
## 
## P value adjustment method: none

Se aprecian diferencias significativas entre el dia 1 y 2, tambien entre el dia 1 y 3.

pairwise.wilcox.test(Conc,Alga,p.adjust="n")
## 
##  Pairwise comparisons using Wilcoxon rank sum test 
## 
## data:  Conc and Alga 
## 
##           Chlamydomona
## Chlorella 3.9e-16     
## 
## P value adjustment method: none

Si se aprecian diferencias significativas entre cada microalga.

Se calculan caracteristicas estadisticas para la expresion de resultados:

tapply(Conc,Alga,mean)
## Chlamydomona    Chlorella 
##      13.0000     205.6222
tapply(Conc,Alga,sd)
## Chlamydomona    Chlorella 
##     12.18606    124.52807
tapply(Conc,Alga,length)
## Chlamydomona    Chlorella 
##           45           45
tapply(Conc,Tratamiento,mean)
##         5        25        50 
##  89.96667  94.16667 143.80000
tapply(Conc,Tratamiento,sd)
##         5        25        50 
##  89.10570  96.42223 182.88972
tapply(Conc,Tratamiento,length)
##  5 25 50 
## 30 30 30
ggplot(aes(y=Conc, x=Alga), data=Datos) + geom_boxplot(aes(fill=Alga))+
  theme_classic() +xlab("Alga") + ylab("Concentración")

ggplot(aes(y=Conc, x=Tratamiento), data=Datos) + geom_boxplot(aes(fill=Tratamiento))+
  theme_classic() +xlab("Tratamiento") + ylab("Concentración")

El crecimiento fue mayor para la Chlorella vulgaris (205.62±18.56, n=45), seguido de la Chamydomona sp. (13±1.82, n=45) de manera significativa (F = 106.65; gl=42; p<0.05). Asi tambien el tratamiento con mayor crecimiento fue el de 50% (143.8±33.39,n=30), seguido del de 25% con (94.17±17.60, n=30) y de ultimo al 5% (89.97±16.26, n=30) de manera no significativa (F=1.0731; gl=26; p>0.05). Asi mismo se realizó una comparación no planeada Pairwise Wilcox Test y se encontraron diferencias significativas entre el Dia 1-Dia 2 (p<0.05), tambien entre el Dia 1-Dia 3 (p<0.05) pero no entre los demas dias (p>0.05). Tambien entre ambas algas (p<0.05)