MetProcesser1.0.2使用说明

介绍

该文档用来介绍MetProcesser的基本使用方法，使用MetProcesser自带的demo data进行演示。

(1)安装MetProcesser

MetProcesser代码存放在Github上，可以直接从github上下载安装，首先需要安装R包：devtools。

 install.packages("devtools")
 library(devtools)
 install_github("jaspershen/MetProcesser")

(2)观看MetProcesser的帮助文档

help(package = "MetProcesser")

(3)准备数据

请将一级数据，二级数据以及数据信息(使用demo data)存放在某个文件夹中，如下图所示：

1. data.csv为数据，行为峰，列为样品。注意必须包含有“name”(峰的名字)，“mz”(质核比)和“rt”(保留时间信息)信息，且列名必须为“name”，“mz”和“rt”。还可以有其他峰的性质，如“adducts”(加合物信息)，“isotopes”(同位素信息)等，其他为样品和QC名字。样品的命名如果有需要隔断的地方，请使用“.”，不要使用“_”，“-”等，开头请勿使用数字。例如，“A210.a”为有效命名，而“123”，“A123-1”为无效命名。并且请注意必须保证data中和sample.information中的样品名完全一样。如下图所示：

2. sample.information.csv为样品信息，第一列为“sample.name”，是样品和QC的名字，注意该名字必须和“data”中的样品名和QC名保持完全一致。第二列为“injection.order”，为样品和QC的进样顺序。第三列为“class”，用来注明每个样品是“QC”或者“Subject”，注意大小写。第四列“batch”，注明每个样品的批次信息。第五列为样品的分组情况，如“control”，“case”，QC样品仍然标注为“QC”。如下图所示:

3. peak identification为可选项，如果数据没有鉴定信息，需要使用QC的鉴定信息与一级信息通过mz和RT匹配进行鉴定，可以建立该文件夹，然后将二级鉴定信息放在此文件夹中，注意每个二级鉴定数据后一定要加上“ms2”的标志。如下图所示：

(4)开始数据的前处理

使用MetProcesser自带的数据进行练习。

(1)设置路径

##demo directory
data(data, package = "MetProcesser")
data(sample.information, package = "MetProcesser")
data(ms2_50_300, package = "MetProcesser")
data(ms2_50_1200, package = "MetProcesser")
data(ms2_290_600, package = "MetProcesser")
data(ms2_590_900, package = "MetProcesser")
dir.create("Demo for MetProcesser")
setwd("Demo for MetProcesser")
path <- file.path(getwd(), "peak identification")
dir.create(path)
write.csv(data, "data.csv", row.names = FALSE)
write.csv(sample.information , "sample.information.csv", row.names = FALSE)
write.csv(sample.information , "new.group.csv", row.names = FALSE)
write.csv(ms2_50_300, file.path(path, "ms2_50_300.csv"), row.names = FALSE)
write.csv(ms2_50_1200, file.path(path, "ms2_50_1200.csv"), row.names = FALSE)
write.csv(ms2_290_600, file.path(path, "ms2_290_600.csv"), row.names = FALSE)
write.csv(ms2_590_900, file.path(path, "ms2_590_900.csv"), row.names = FALSE)

(2)读取数据

MetFlowData <- ImportData(data = "data.csv",
                          sample.information = "sample.information.csv",
                          polarity = "positive")

MetFlowData是一个标准的在MetProcesser软件中进行数据处理的类，可以使用下列方式直接观察数据信息。

MetFlowData

(3)缺失值的筛选和补齐(如果数据没有缺失值可以跳过该步骤)

首先使用函数MVOverview观察数据的缺失值情况。

MVOverview(MetFlowData = MetFlowData, path = "MV overview")

会建立一个新的文件夹，命名为“MV overview”，如下图所示：

“MV overview”包含每个batch的缺失值分布情况，如下图所示：

使用函数MVFilter对数据进行缺失值筛选。

MetFlowData <- MVFilter(MetFlowData = MetFlowData,
                         obs.mv.per.cutoff = 0.5,
                         var.mv.per.cutoff = 0.5,
                         path = "MV filter")

MVfilter根据每个峰以及每个样品的缺失值的比例进行筛选，默认如果峰(在QC或者subject中)或者样品中缺失值的比例超过50%，则该峰或样品将被去除掉，如果没有峰或者样品满足条件，则运行结果如下图所示：

然后对数据进行缺失值补齐。

MetFlowData <- MVimputation(MetFlowData = MetFlowData,
                            ##MV imputation method
                            imputation.method = "knn",
                            #knn parameters
                            k = 10,
                            rowmax = 0.5,
                            colmax = 0.8,
                            maxp = 1500)

(4)零值的筛选

首先使用函数ZeroOverview观察数据的零值分布情况。

ZeroOverview(MetFlowData = MetFlowData, path = "Zero overview")

会建立一个新的文件夹，命名为“Zero overview”，如下图所示：

“Zero overview”包含每个batch的零值分布情况，如下图所示：

使用函数ZeroFilter对数据进行零值值筛选。

MetFlowData <- ZeroFilter(MetFlowData = MetFlowData,
                         obs.zero.per.cutoff = 0.5,
                         var.zero.per.cutoff = 0.5,
                         path = "Zero filter")

Zerofilter根据每个峰以及每个样品的零值的比例进行筛选，默认如果峰(在QC或者subject中)或者样品中零值的比例超过50%，则该峰或样品将被去除掉，如果没有峰或者样品满足条件，则运行结果如下图所示

：

(5)标出QC中的outlier(使用PCA score plot)

使用QCOutlierFinder寻找QC中的outlier

qc.outlier.data <- QCOutlierFinder(MetFlowData = MetFlowData,
                         CI = 0.95,
                         path = "QC outlier finder")
MetFlowData <- qc.outlier.data[["MetFlowData"]]

新建立一个文件夹“QC outlier finder”, 里面包含了每个batch中的QC outlier。如下图所示：

处于PCA score plot95%置信区间以外的认为是outlier，并且被标记为红色。本例中没有outlier。

(6)使用MetabolitePlot观察每个feature在不同batch中的变化，如果只有一个batch可以跳过该步骤

MetabolitePlot(MetFlowData = MetFlowData,
              path = "metabolite plot before integration")

(7)对数据进行normalization，默认为SVR normalization。

MetFlowData <- DataNormalization(MetFlowData = MetFlowData,
                                method = "svr",
                                threads = 2)

新建立一个文件夹“Normalization result”, 里面包含了每个batch中的normallization result。如下图所示：

每个batch分别进行normalization

每个batch的normalization结果如下图所示：

(8)标出样品中的outlier(使用PCA score plot)

使用SubjectOutlierFinder寻找样品中的outlier

subject.outlier.data <- SubjectOutlierFinder(MetFlowData = MetFlowData,
                         CI = 0.95,
                         path = "Subject outlier finder")
MetFlowData <- subject.outlier.data[["MetFlowData"]]

新建立一个文件夹“Subject outlier finder”, 里面包含了每个batch中的subject outlier。如下图所示：

处于PCA score plot 95%置信区间以外的认为是outlier，并且被标记为红色。

(9)下面开始进行物质鉴定(已经鉴定过的可以省略过这一步)

MetFlowData <- PeakIdentification(MetFlowData = MetFlowData,
                               ##parameters for matching
                               mz.tolerance = 25,
                               rt.tolerance = 180)

在“peak identification”文件夹中新建立一个文件夹“matching result”, 里面包含了鉴定结果。

而“identification.information.txt”则包含了一些鉴定结果信息。

(10)使用BatchEffectOverview观察batch effect，如果只有一个batch可以跳过该步骤

BatchEffectOverview(MetFlowData = MetFlowData,
                   path = "Batch effect before integration")

分别使用QC，subject的PCA score plot以及QC的total intensity分布来展示batch effect:

(11)使用RSDoverview观察RSD分布

RSDoverview(MetFlowData = MetFlowData,
              path = "RSD overview before integration")

(12)利用QC进行不同batch之间的整合，如果只有一个batch可以跳过该步骤

MetFlowData <- DataIntegration(MetFlowData = MetFlowData)

(13)使用BatchEffectOverview观察整合之后batch effect，如果只有一个batch可以跳过该步骤

BatchEffectOverview(MetFlowData = MetFlowData,
                   path = "Batch effect after integration")

(14)使用MetabolitePlot观察整合之后每个feature在不同batch中的变化，如果只有一个batch可以跳过该步骤

MetabolitePlot(MetFlowData = MetFlowData,
              path = "metabolite plot after integration")

(15)使用RSDoverview观察RSD分布

RSDoverview(MetFlowData = MetFlowData,
              path = "RSD overview after integration")

(16)使用DataOverview对处理之后的数据进行一个概览

DataOverview(MetFlowData = MetFlowData,
             feature.distribution = TRUE,
             path = "Data overview")

“Data overview.txt”记录了数据的一些基本情况

“Data overview_RT vs mz vs intensity.pdf”展示了峰的分布

(17)将数据输出为csv格式。

OutputMetFlowData(MetFlowData = MetFlowData,
                  data.name = "data_after_pre",
                  subject.info.name = "subject.info",
                  qc.info.name = "qc.info",
                  path = NULL)

数据会输出为“data_new.csv”,“subject.info.csv”和“qc.info.csv”。

---

(5)开始数据的前处理

数据前处理结束之后，可以进行简单的统计分析。

(1)首先给与正确的分组信息，如果对于原“sample.information.csv”中的分组信息不满意，可以使用函数ReChangeGroup给与数据新的分组信息，在原来的“sample.information.csv”中修改“group”信息，然后重新命名为“new.group.csv”，放在文件夹中。

MetFlowData <- ReChangeGroup(MetFlowData = MetFlowData)

(2)对数据进行PCA分析

PCAanalysis(MetFlowData = MetFlowData,
            QC = TRUE,
            scale.method = "auto",
            path = "PCA analysis")

(3)对数据进行PLS analysis

PLSanalysis(MetFlowData = MetFlowData,
                   #used data
                   scalemethod="auto",
                   path = "PLS analysis")

结果存放在“PLS analysis”中。

MetFlowData <- ReChangeGroup(MetFlowData = MetFlowData)

(4)对二分组的数据计算fold change

MetFlowData <- FoldChange(MetFlowData = MetFlowData,
                          to = c("case", "control"),
                          ratio = "median")

(5)对二分组的数据差异性分析

MetFlowData <- UnivariateTest(MetFlowData = MetFlowData,
                              test.method = "t",
                              adjust.method = "fdr")

(6)根据fold change和p value筛选生物标志物

MetFlowData <- MarkerSelection(MetFlowData = MetFlowData,
                               foldchange = "foldchange",
                               p = "p",
                               foldchange.cutoff = c(4/3, 3/4),
                               p.cutoff = 0.05,
                               path = "marker selection")

(7)画火山图

VolcanoPlot(MetFlowData = MetFlowData,
            foldchange = "foldchange",
            p = "p",
            col = c("black", "firebrick1"),
            foldchange.cutoff = c(4/3, 3/4),
            p.cutoff = 0.05,
            path = "marker selection")

(8)将选到的marker变化画出来

MarkerShow(MetFlowData = MetFlowData,
           beeswarm = T,
           path = "marker selection")

(9)输出最后的数据为csv格式

OutputMetFlowData(MetFlowData = MetFlowData,
                  data.name = "data_after_Stat",
                  subject.info.name = "subject.info",
                  qc.info.name = "qc.info",
                  path = NULL)

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可以直接使用函数MetPre对数据直接进行所有的前处理

MetPre(#ImportData para
       data = "data.csv",
       sample.information = "sample.information.csv",
       polarity = "positive",
       #DataNormalization
       method = "svr",
       threads = 2)

可以直接使用函数MetStat对数据直接进行所有统计分析

  MetStat(MetFlowData = MetFlowData,
          new.group = TRUE,
          #PCA analysis para
          QC = TRUE,
          scale.method = "auto",
          #FoldChange para
          to = c("case", "control"),
          ratio = "median",
          #UnivariateTest para
          test.method = "t",
          adjust.method = "fdr",
          #MarkerSelection para
          foldchange = "foldchange",
          p = "p",
          foldchange.cutoff = c(4/3, 3/4),
          p.cutoff = 0.05,
          #MarkerShow para
          beeswarm = TRUE)