2016 독성학 전문교육과정

Session I 2016-08-22

독성학 개론 및 발현기전 !!!!

  • 홍진태: 충북대학교
  • 독성학에 많은 분야가 있다. (규제독성학 : 가습기살균제)
  • Toxin vs Toxicant man-made
  • Toxicity, Hazard(상태), Safety(risk의 반대 개념), Risk(probability), Risk Assessment
  • Idiosyncratic reaction, delayed toxicity(중국에서 온 조류, 잔류성 농약 먹고 우리나라 와서 독성)
  • 화학적 상호작용 - Additive, synergistic, potentiation, antagonism
  • 용량-반응관계 - 유해성 평가에서 중요한 factor - Dose-response - sigmoid하게 나타난다. 그룹별로 나타난걸 Quantal이라고 한다.
    • 직선형으로 표현할 수도 있다.
    • 기울기도 봐야 한다. B는 다루기가 힘든 약 (Steep) LD50는 같을 지라도 주의해야 한다.
  • 효력Potency vs 효능efficacy
    • Morphine / aspirin
  • Therapeutic index - LD50/ED50
  • Margin of safety - LD1/ED99
  • Margin of exposure = exposure level / TD10
  • Subchronic / chronic dose response - Liver necrosis - LOAEL NOAEL(No observed AE level)
    • ADI, RfD, TDI 만성 노출에 대한 허용치를 결정하는 전형적인 시발점
    • Benchmark dose (모델링을 사용해서 결정)
  • threshold
  • 독성 영향 인자
    • selective
    • 생체내 전환
    • malathion : 사람 vs 곤충(곤충에만 축적)
    • 빈도, 농도, 용량, 부위, 경로, 시각(chronopharmacology)-마우스 KCN치사율에 대한 circadian susceptibility(심박동 낮고 안정화된 아침에 투약)
    • 내인성 인자: 종, 성별, 연령, 체중/신체구성
  • 동물 독성 연구 - 동물에서의 노출과 영향을 연구
    • TCDD에 노출된 rat의 종양 발생
  • 독성 시험의 유형 - 단회, 반복 투여 독성 시험, 유전 독성, 면역 독성, 발암성 시험, 국소 독성 시험, 메커니즘 연구, OMICS 활용 독성
  • Mechanism of Toxicity
    • Delivery, Reaction, Toxicity, Repair
  • Exposure of Toxic chemicals -> Ultimate toxicant + Target molecule
  • Type of Ultimate toxicants and their sources
    • 대사체가 xenobiotic toxicant
    • Reactive oxygen or nitrogen species as ultimate toxicants
    • Endogenous compounds as ultimate toxicants (lipid - peroxidation, Bilirubin)
  • Distribution (Specialized transport - ochratoxi, MPTP into DA neuron
  • Accumulation (Away from the target - MDR)
  • Excretion vs reabsorption
    • Excretion (volatile, non-volatile)
    • reabsorption (tubular fluid reabsorption, carrier in kidney, intestinal lumen) - 우리 몸에선 약산, 약알칼리, 중성의 약물 - PH가 중요하다. PKA
      • salicylic acid (알칼리에서 reabs 감소), morphine(산성에서 reabs 감소)
  • Toxication vs detoxication
    • electrophiles : nonionic, cationic
    • nucleophiles : amygdalin -> cyanide
    • free radical formation
      • Xenobiotics -> super oxide
      • P450 reductase PQ, DR, NF 전자를 하나 받아서 reduct한 효소로 바뀐게 산소와 반응해서 free radical 만들게 된다. reduce된다. (전자빠지면서) reactant가 된다.
      • Endogenous sources of O2
      • One electron oxidation by peroxidases or P450
      • superoxide anion radical toxication
    • Detoxication of free radical
      • SOD, Catalase, GPX, HO(ineffective), ONOO- : free radical scavenge
  • Reaction (반응 - ultimate toxicants-target)
    • Target molecule(DNA, ptn, memb lipid, coenzyme)
    • Types of reactions
      • Non-covalent : hydrogen, memb receptor, PKC, acridine
      • Covalent
    • hydrogen abstract :
      • R-SH -> RS*
      • CH3 -> CH2*, DNA -> C4 radical, lipid - lipid peroxidation
    • effects of toicants on targets
      • dysfunction of target (mimicking endogenous ligands, morphine(opiate receptor), protein function impairment
      • destruction of targets
      • cellular dysfunction
      • TK, GPCR, Hormone receptor
      • excitable cell dysfunction - alternation of signal
      • cocaine (adrenergic vasoconstriction)
  • Toxic alternation
    • Mechanism of apoptosis + ATP depletion, Ca increase, overpopulation of ROS(PARP increase - DNA injury))
    • Protein repair(ubi, autophagy)

면역독성 !

  • 최경철: 충북대학교
  • Introduction to WBC
  • Introduction to lymphoid organs
  • Sentinal cells - MQ, DC, Mast cells
  • Structure of LN - B cell은 cortex에 존재함. Ag 만나 proliferation -> class switching (항체를 만든다, cortex에서)
  • Structure of spleen - Red pulp (RBC), white pulp(WBC)
  • Hypersensitivity reactions (과민반응) - I, II, III(혈관염), IV
  • Quiz:
    1. Acquired immunity - B cells
    2. BCR -> antibody
    3. Helper T -> CD4
    4. major 2차면역기관 - A,E
  • ICH.org - E2B, CTD, MedDra
  • ICH S6 guideline - TDAR, phenotyping 등을 해야 한다.
  • S8 guideline (immunotoxicology studies) - STS (standard toxicology study) -> factors to consider in the eval of potential immunotoxicity
  • Hapten (low MW, unpredictable, immunogenecity)
  • Introduction to antibody
  • Type II, III - no standard, non-clinical test (Coombs test)
  • murine LLNA (local LN assay) - thymidine -> DNA 합성시 incorporation - beta counter로 잴 수 있다.
  • Quiz:
    1. 면역독성 카테고리 포함 안되는것? - Abnormal APC (IS, IG, HS, AI)
    2. 면역조직 아닌거? - Thyroid gl.
    3. Type IV 과민증 (Buehler , maximization, optimization) 아닌것은?
    4. Passive cutaneous anaphyl, maxi test - 동물은? guinea pig
    5. Autoimmunity 비이상적인 현상
    6. ImmunoSuppression 아닌 것은? myelosupp, 면역 기관 위축, serum globulin증가(wrong!), 감염증가

독성시험과 통계 !!

  • 이영주: 경희대학교
  • 기술통계, 추측통계
  • 대표값 + 산포도
  • 산술평균 - 극단치에 영향을 많이 받음, 명목변수, 순위변수에는 부적합(예-암1기, 2기), skewed distribution에는 부적합
  • 기하평균 - 분포가 한쪽으로 치우쳐 로그변환하여 사용하는 경우(Cmax), 곱셈으로 계산하는 값의 평균 (AUC)
  • 대부분의 경우는 SD가 옳다. 산포성 SD. 통계처리시 SE. 추측통계시.
    • triplicate를 세번이상 하는 경우는 SE써도 된다.
  • 추측통계
    • 모수 - 모집단을 대표.
    • 신뢰구간 point estimate 99%CI -> 더 넓어진다. (90% CI에 비해)
  • 통계적 가설검증 (귀무가설을 기각)
  • 검정통계량 - 가설의 옳고 그름을 판단. - 계산.
  • talpha/2 = 3.182 이상이면 H0(귀무가설) 기각영역
  • Decision Tree
  • 서열척도(ordinal scale) - 비모수적 Spearman, MW U test, Kruskal-Wallis

독성병리 !!

  • 김용범: 안전성평가연구소
  • 같은 동물인데도 병리가 다를 수 있다. (정상이 다를 수 있어.)
  • 시험물질 관련 조직변화를 표로 작성하여 소견의 중요성을 판단
  • periportal vacuolation. Artifact. inadequate artifact.
  • 부검 : 가장 중요함.
  • gross 소견 기술: 출혈보다 discoloration. 표준화 통일화
  • 장기중량 측정.
  • 표준화된 방식으로 삭정( 잘라야 함. ) 같은 조직은 일관성 있게.
  • 독성병리학자. 표준화된 표로 정리할 수 있는 능력.
  • 대조군의 중요성 강조. 수컷 대조군- 수컷 고용량 - 저용량 순서로 한다.
  • 현미경 진단.
    • STP. ESTP. BSTP. JSTP. 표준화를 위한 기관들.
    • 위치. - necrosis, neuron, hippocampus, brain
    • 분포 - 국소, 다소성, 미만성.
    • 병변 등급 - 주관적일 수 있다
    • Apoptosis- 세포막 손상 없다. necrosis - 광범위 세포막 손상 -> 염증
    • 병적과정 - 혈행 장애.
    • 치유 및 수복 - 재생, 반흔(섬유화)
    • 적응 기전 : 위축, 비대, 과형성, 화생.
    • 종양: 세포조절 안됨.
  • Peer review
  • 아급성 혹은 만성 설치류 독성 시험. 암수 대저군 1마리(25%) 임의 5마리 고농도(10%) : 모든 슬라이드 동료 검토
  • Pathology working group. PWG. 병리전문가 패널. - 검토는 어떻게 수행? 각자의 의견을 투표. 의견이 틀릴때는 조율. 최종적으로 다수에 의해.

비임상시험결과의 임상시험 연계 !!!!

  • 반복투여가 중요함. (NOAEL) - 대조군 대비 부작용이 유의하게 증가하지 않는 최고용량. 생물학적 유의성이 중요. (통계적 유의성이 없더라도)
  • FDA pregnancy categories, IARC Carcinogens classification (group 1, 2, 3, 4)
  • 반복투여 독성 시험 NOAEL을 잘 잡잡기 위해 4번의 기회가 있다.
  • 단기(4주)~ pivotal.
  • 단기에서 독성을 잘 봐야함. 충분히 높은 용량으로 시작한 뒤에 낮춰가는 쪽으로 해야 함. 그 반대는 참 힘들것.
  • Safety margin = NOAEL에서의 exposure / MRHD에서의 exposure
    • exposure가 중요하다.
  • 비임상시험의 적용
    • 누구를 대상으로? 최초 투여 용량은 어떻게 결정하는가? 용량 얼마씩 증량
    • 이런 질문이 비임상시험에서 나오게 된다.
  • Phase 1a (FIH) 임상시험대상자 (환자 vs 건강인?)
    • 비임상시험 결과 -> Seriousness? measurable? -> if no, 환자관련 의약품. If yes, 건강한 시험대상자
  • Clinical starting dose 설정법
  • NOAEL/PAD based approach - estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials (2005-07)
    • 초기 임상개시 가능 최고 용량 (MRSD)
      1. 각 동물 종의 NOAEL결정
      2. HED 계산
      3. 가장 적당한 동물종 선정
      4. safety factor 적용
      5. MRSD의 산정
      6. PAD고려하여 선정.
  • Human equivalent dose (HED) calculation
    • 사람 용량으로 외삽하는 가장 적합한 방법을 사용하여 HED 산출. (체표면적에 따라서) mg/kg을 mg/m2으로 변경해 준다.
    • km mouse 3 rat 6 monkey 12 dog 20 human 37
    • h:Donkey:Monkey(rabbit):Rat:mouse = 1:2:3:6:12(mg/kg) = 동일 mg/m2
    • mouse 120mg/kg * 3/37 = human 10mg/kg, rat 60mg/kg = human 10mg/kg
  • Most appropriate species selection
    • 적당한 종을 사용해라. 잘 모를때는 더 민감한 동물 써라. HED가 더 낮은 동물을 선택하면 된다.
  • safety factor application - 좀 낮춰서 투약하자.
    • Default safety factor = 10
  • MRSD 산정(Maximum recommended starting dose)
  • Quiz : rat 4주 반복 독성 시험에서의 NOAEL 60mg/kg. Rat는 appropriate, safety factor = 10.
    • 60mg/kg rat km = 6, human 36, 나누면 1mg/kg이 된다. 60kg라고 보면 60mg으로 하면 된다.
    • HED = 60mg/kg * 6/37 = human 10mg/kg
    • MRSD = HED / SF = 10/10 = 1mg/kg = 60mg
  • PAD (Pharmacologically active dose, PAD) 고려.
    • PAD = 3mg/kg일때 임상 초회 용량 30으로 할 수 있다.
  • MABEL Guideline
    • TGN1412 (CD28-Super Mab)
    • HED 16 mg/kg , safety factor 160
    • 원숭이 NOAEL = 50mg/kg (BSA based HED = 16mg/kg)
    • 원숭이 PAD = 2.5 - 25 mg/kg 원숭이 PAD-HED = 0.8 ~ 8 mg/kg , starting dose = 0.1mg/kg
    • 사고 이후의 주장들 1. 5ug/kg 2. 3ug/kg으로 해야한다. 3. receptor occupancy - antagonist는 90% receptor occupancy가 적합. agonist는 10% receptor occupancy면 충분함. 이를 위해서는 1ug/kg면 충분함.
    • MABEL 아마도 사람에게서 약효가 나타날 용량. Minimal anticipated biological effect level)
    • 2007-06 새로운 가이드라인 제정됨.
    • animal in vitro -> allometric equation 산출 - animal in vivo
    • human in vitro -> 적용 . human MABEL 산출
  • PK-guided approach - dose대신 전신 노출(systemic exposure) 이용하여 동물 결과를 외삽(extrapolation)
    • SD ( starting dose) = AUC * CLh
    • NOAEL 비글에서 AUC 20ug*hr/mL 예상되는 제거율은 CLh = 15L/hr 효력의 차이는 0.1 EC50/EC50
  • 건강인 아닌 악성 종양 환자에서의 starting dose
    • 항암제에서.. 주료.
    • ICH S9
      • 57개의 임상시험을 다 분석했다. 여기서 나온 공식으로 계산.
  • 임상-비임상 밀접한 관련.
    • 개별 임상시험의 특성
  • NOAEL/PAD based approach
  • MRSD = NOAEL * (kmanimal/kmhuman)/SF

Session II 2016-08-23

오믹스 기반을 이용한 독성평가 !

  • 최진희 서울시립대학교
  • systems toxicology - science+engineering+computing Multi-omics technology
  • biological model 만들어.
  • in silico - combination - 더 넓은 독성 개념을 얻을 수 있어
  • 개발의 platform으로 사용할 수 있음.
  • Exposure -> molecular -> cellular -> organ responses -> organism responses -> population responses
  • Integration is the key.
  • New regulation (i.e. REACH), TOX21, TOX CAST
  • adverse outcome pathway
  • Benchmarks in Toxicology

독성동태 및 대사 !!!

  • speaker: 신소영(원광대 약학대학)
  • Efficacy 의약품의 효능 - 약물활성(Activity, A), 감수성(Sensitivity, S), 약물농도(Concentration, C)
  • 약물의 조직에서 농도대신 약물농도에 혈중 약물 농도 변화로 효능을 기술가능. (가정)
  • ADME
  • toxicokinetics - 정의 : 약효를 기대하지 않는 농약이나 일반 화학물질의 체내 동태
    • ICH 가이드라인
    • 독성시험기준 정의 : 독성시험 수행시 시험물질의 전신노출도 평가하기 위해 약물동태학적 자료를 산출하는 시험.
  • Model
    • 가장 간단한 모델만 사용할 것임
    • 대부분의 약물은 one compartment model로 설명이 됨.
    • Compartment model, PBPK model
    • zero- and first-order elimination
  • CL
    • rate of elimination / concentration = dX/dt / Cp - 약물이 혈중에서 소실되는 속도를 혈중 약물 농도로 나누어준 값 =
    • CL is dose divided by AUC
  • F
    • 약물 또는 그 활성대사체가 제제로부터 전신 순환혈로 흡수되는 속도와 양의 비율
    • IV는 F=1
  • 비선형성
    • 흡수 riboflavin(transporter GI 포화)
    • 높은 농도에서는 모든 효소가 포화되어 0차반응에 가까워짐
    • 낮은 혈중 농도에서는 1차반응에 가까워짐.
  • Michaelis-Menten
    • 소실속도 = -dC/dt = VmaxC/Km+C
    • 약물농도가 Km보다 훨씬 클때 -dC/dt = Vmax
    • 훨씬 작을때 -dC/dt = Vmax*C/Km
    • 선형동태구간/비선형동태구간

유전독성 및 발암성 !!

  • speaker: 김지영(안전성평가연구소) fnkim@kitox.re.kr
  • 3 primary test battery (OECD)
    • 화장품에 대한 독성자료 (유럽)는 안받고 있다. 화장품, 유럽은 염색체 빼고 해야함.
  • ICH
  • Aim of genetic toxicology testing
    • Genotoxicigy, mutagenicity
  • Forward mutation(braoder mutagen identification)
  • Backward mutation(reversion) - more restricted and accurate
  • TG490
    • in vitro genetic toxicology test
    • mouse lymphoma assay
    • TK6 assay로 불리기도 한다.
  • Chromosomal abberation
    • 수적 이상
    • 구조적 이상
    • pre-S : chromosome abberration vs post-S : chromatid abberation
  • In vivo genetic toxicology tests
    • Tests for primary DNA damage(3 battery에는 안들어가.)
      • Fast, single-strand breaks(SSB) and/or alkali-labile sites(ALS)
      • Liver and stomach were used. (가장 중요한 장기)
  • Sens and spec
    • MN, CA, MLA는 specificity가 낮다. (S9 처리해서 phase I은 많이 하지만 phase II(detoxification)를 구현할 수 있는 in vitro시험은 없기 때문에 specificity 낮음)
  • 발암성 시험
    • detection of potential to induce neoplastic lesions
    • 요구되지 않는 경우 - 악성종양치료제, 3년 이내 생존
  • “예전거로 해주세요.”
    • 개정된 시험이 더 고비용이기 때문에 요청하는 경우가 많다.
    • 그러나 그렇게 하면 안된다.

신경독성 !

  • 위명복: 강원대학교
  • 산화적 손상에 대한 신경계 취약성
    • 항산화방어기전 중등도 낮음(catalase, GPx, vit-E)
    • tight junction 단백감소, MMP 간접활성
    • microglia에 의한 ROS 및 cytokine 생산.
  • 신경손상 형태
    • neuronopathy -> gliosis (methyl mercury, Tins, MPTP(heroin))
    • myelionopathy
  • TG: 설치류 신경독성평가, 발달 신경독성평가
  • Neurotoxicity screening battery
    • Tier 1 - FOB, locomotor, GFAP ELISA, histopathology
    • Tier 2
  • 비동물대체법(non-animal alternative methods)
    • 세포를 가지고 하는 것이다.
    • 대체한계성 - 모든 것을 대체할 수 없다.
  • Stroke, parkinson, SCI, etc..
  • CNS injury marker - BBB(Evan’s), microglia(OX-42), etc..

식품의 위해도 평가 !

  • 최시내 케이앤에이컨설팅
  • 체내로 유입되는 양이 중요함
  • 급성 섭취 노출량 예측
    • 잔류량이 composite 분석 결과에 해당.
  • 노출 평가
  • 용량-반응 관계 규명
    • extrapolation : high-dose -> low-dose
    • 기본 원칙 : threshold approach, non-threshold approach
    • Non threshold -> extrapolation
      • cancer potency = Q1star = upper bound
    • Threshold approach - NOAEL
      • NOAEL을 활용한 RfD의 유도
      • NOAEL or LOAEL / UF x MF ; UF = uncertainty factor
  • Risk characterization
    • Threshold
      • Hazard quotient = [exposure level] / [reference dose]
      • exposure와 reference dose는 동일한 노출 기간에 근거

생식발생독성 !

  • 김종춘: 전남대학교
  • segment I, II, III (KFDA, ICH)
    1. Fertility and early embryonic development study
    2. Embryo-fetal development study
    3. Peri- and postnatal development study
  • Segment I
    • Stage I ~ XIV - 56일 걸린다.
    • 같은 stage끼리 비교해야 함.
  • Segment II
    • 기형변이
    • teratogenesis
    • 600kda 이하의 분자량이어야 태반 통과.
    • 연골 + 경골의 염색
  • Segment III
    • 한배새끼관찰, F1 성장, 행동, 생식기능시험
  • Key point
    • 생식발생 위해성 급증
    • 시험법
    • 실험동물 종과 계통 선택
    • 결과의 해석
    • 종류와 특성 및 작용 기전
    • 3Rs principle