Relatório preliminar para decisão de método de extração em metabolômica untargeted
Projeto: Candida tropicalis - Bruno
Data: 2026-07-07
Analise: UHPLC-QTOF/MS, modos positivo e negativo
Objetivo
Este relatório tem como objetivo comparar o desempenho dos métodos de extração ACN e MeOH quanto à recuperação de sinais/features metabolômicas, reprodutibilidade e qualidade dos dados.
A identificação química das features não foi realizada nessa etapa, em função do objetivo ser uma escolha metodológica. Mas pode ser realizado caso seja necessário.
Pergunta principal
Comparar ACN e MeOH como modos de extração, usando cobertura de features, missing, reprodutibilidade em QC e separação exploratória entre grupos.
Resumo executivo
- O pipeline XCMS foi executado com sucesso nos modos positivo e negativo.
- O modo positivo apresentou maior cobertura de features do que o modo negativo.
- A diferença entre ACN e MeOH foi mais evidente do que a diferença entre D e S.
- MeOH apresentou maior número mediano de features presentes e menor proporção de valores ausentes em ambas as polaridades.
Dados e processamento
Foram processados 21 arquivos por polaridade, incluindo amostras
biologicas, controles MeOH e QCs. Os parâmetros de detecção foram
definidos a partir de um piloto balanceado com amostras biológicas e
comparação de três configuracoes de CentWaveParam.
A configuração escolhida foi:
CentWaveParam(
ppm = 15,
peakwidth = c(4, 25),
snthresh = 10,
prefilter = c(3, 600),
noise = 500,
integrate = 1,
mzdiff = -0.001
)Etapas executadas: detecção de picos, agrupamento inicial, correção de tempo de retenção por Obiwarp, reagrupamento, preenchimento de picos faltantes e filtragem por critérios de qualidade.
Figuras principais
Figura 1. Features presentes por condicao
Figura 2. Missing por condicao
Figura 3. Resumo dos filtros e CV dos QCs
Figura 4. PCA das amostras biologicas - positivo
Figura 5. PCA das amostras biologicas - negativo
Resumo numerico
Resumo do pre-processamento
| Polaridade | Amostras | Picos detectados | Picos finais | Features finais | Missing (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| pos | 21 | 3808 | 6072 | 461 | 41,6% |
| neg | 21 | 1202 | 1803 | 128 | 42,7% |
Filtros de qualidade
Foram aplicados filtros de presença em condiçes biológicas, razão amostra/controle MeOH e CV nos QCs. Como o controle MeOH não é necessariamente um branco formal perfeito, a matriz recomendada preserva uma abordagem auditável e menos agressiva. (Isso em função daqueles arquivos que não sabemos se é um controle mesmo).
| Polaridade | Features totais | Filtro recomendado | Filtro estrito QC | Missing mediano por amostra | Missing mediano por feature | CV mediano QC |
|---|---|---|---|---|---|---|
| pos | 461 | 277 | 252 | 42,3% | 38,1% | 24,6% |
| neg | 128 | 96 | 77 | 41,4% | 33,3% | 24,8% |
Resultados exploratórios
A anaálise exploratória foi feita somente com amostras biológicas, usando a matriz filtrada recomendada.
| Polaridade | Amostras biologicas | Features analisadas | Features exclusivas | ACN vs MeOH p<0,05 | ACN vs MeOH padj<0,05 | D vs S p<0,05 | D vs S padj<0,05 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| pos | 16 | 277 | 28 | 126 | 102 | 55 | 0 |
| neg | 16 | 96 | 4 | 34 | 22 | 33 | 2 |
Cobertura por condição - modo positivo
| Condicao | Solvente | Modo | n | Features presentes mediana | Intensidade total mediana | Missing mediano |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ACN_D | ACN | D | 4 | 171,5 | 3.241.500 | 38,1% |
| ACN_S | ACN | S | 4 | 153,0 | 2.511.345 | 44,8% |
| MeOH_D | MeOH | D | 4 | 235,0 | 4.685.330 | 15,2% |
| MeOH_S | MeOH | S | 4 | 234,5 | 4.351.741 | 15,3% |
Cobertura por condição - modo negativo
| Condicao | Solvente | Modo | n | Features presentes mediana | Intensidade total mediana | Missing mediano |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ACN_D | ACN | D | 4 | 72,5 | 1.082.487 | 24,5% |
| ACN_S | ACN | S | 4 | 64,5 | 556.895 | 32,8% |
| MeOH_D | MeOH | D | 4 | 88,5 | 1.078.801 | 7,8% |
| MeOH_S | MeOH | S | 4 | 87,5 | 897.961 | 8,9% |
Features exclusivas por condição
Modo positivo
| exclusive_condition | n_exclusive_features |
|---|---|
| ACN_D | 21 |
| ACN_S | 5 |
| MeOH_S | 2 |
Modo negativo
| exclusive_condition | n_exclusive_features |
|---|---|
| ACN_S | 3 |
| MeOH_D | 1 |
Top features exploratorias ACN vs MeOH - modo positivo
| Feature | mz | RT (min) | log2FC ACN/MeOH | p | padj |
|---|---|---|---|---|---|
| FT235 | 381,1876 | 9,72 | -10,94 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT330 | 502,3154 | 11,20 | -10,34 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT336 | 508,2741 | 11,20 | -10,11 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT294 | 439,2293 | 10,14 | -8,58 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT320 | 485,2885 | 11,19 | -7,92 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT278 | 419,1505 | 1,71 | 7,54 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT114 | 272,2578 | 8,46 | -6,64 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT334 | 507,2708 | 11,19 | -5,73 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT338 | 520,3386 | 9,53 | -4,33 | 0.000939 | 0.0051 |
| FT078 | 231,2507 | 8,32 | -4,07 | 0.000939 | 0.0051 |
Top features exploratorias ACN vs MeOH - modo negativo
| Feature | mz | RT (min) | log2FC ACN/MeOH | p | padj |
|---|---|---|---|---|---|
| FT088 | 447,1337 | 8,41 | -4,32 | 0.000939 | 0.01 |
| FT029 | 276,0517 | 1,56 | 3,71 | 0.000939 | 0.01 |
| FT017 | 215,0319 | 1,60 | -2,90 | 0.000939 | 0.01 |
| FT113 | 656,8842 | 1,47 | -1,75 | 0.000939 | 0.01 |
| FT105 | 588,8968 | 1,47 | -1,71 | 0.000939 | 0.01 |
| FT071 | 384,9346 | 1,47 | -1,67 | 0.000939 | 0.01 |
| FT099 | 520,9093 | 1,47 | -1,46 | 0.000939 | 0.01 |
| FT119 | 724,8718 | 1,47 | -0,90 | 0.000939 | 0.01 |
| FT100 | 529,2802 | 11,15 | NA | 0.000939 | 0.01 |
| FT068 | 383,1890 | 12,81 | -5,91 | 0.00136 | 0.0109 |
Interpretação
A diferença entre ACN e MeOH foi mais consistente do que a diferença D/S. No modo positivo, ACN vs MeOH apresentou 102 features com padj < 0,05, enquanto D vs S não apresentou features significativas após ajuste. No modo negativo, ACN vs MeOH apresentou 22 features com padj < 0,05 e D vs S apenas 2.
Para a decisão metodológica, isso indica que a escolha do solvente de extração tem impacto maior que a condição D/S na recuperacao global de sinais. Como MeOH apresentou maior cobertura e menor missing, ele é o candidato preferencial.
Limitação importante
As features não foram anotadas quimicamente. Isso não impede a decisão sobre desempenho de extração, mas significa que o relatório avalia cobertura e qualidade de sinais, não identidade de metabólitos específicos.
Conclusão preliminar
Para o objetivo de seleção do método de extração, os resultados favorecem MeOH, que apresentou maior número de features detectadas, menor proporção de valores ausentes e maior intensidade total nas duas polaridades. O modo positivo apresentou maior cobertura geral e pode ser priorizado para análises subsequentes.
Proximos passos recomendados
- Confirmar MeOH como método preferencial.
- Definir se será usado modo positivo, negativo ou ambos.
- Rodar o processamento final com os parâmetros definidos.
- Exportar matriz final para documentação/arquivamento.