Elif Alaca, Sem van Beek, Cynthia Chen, Qiana Filet, Pauline van der Linde en Nardos Weldeghebreal

2026-06-16

Gegevens

Namen/Studentnummers:

  • Sem van Beek, 1900688
  • Qiana Fillet, 1895361
  • Pauline van der Linde, 1909423
  • Nardos Weldeghebreal, 1801807
  • Cynthia Chen, 1871684
  • Elif Alaca, 1909944

Leerteam:

  • V1201-A

Data experimenten:

  • Dagdeel 3: 12-05-2026
  • Dagdeel 4: 22-05-2026
  • Dagdeel 5: 28-05-2026

Cursus:

  • Project humane ziekten

Tutor:

  • Ruud Nederstigt

Inleiding

Introductie Daphnia

Watervlooien (Daphnia) zijn kleine zoetwaterkreeftachtigen die veel voorkomen in meren en vijvers. Door hun snelle ongeslachtelijke voortplanting kunnen populaties snel opbouwen en zijn ze makkelijk in grote aantallen te kweken.

Daphnia heeft een dun exoskelet en een eenvoudig, goed zichtbaar inwendig orgaansysteem. De combinatie van de kleine omvang, makkelijke kweek en het vergelijkbare cardiovasculair systeem met de mens maakt de Daphnia een geschikt proefdiervrij modelorganisme voor cardiovasculair onderzoek.

Introductie onderzoek

De onderzoeksvraag van voorgaand onderzoek luidde: “Kan de watervlo (Daphnia) bijdragen aan proefdiervrij testen door te worden ingezet om het effect van de bètablokkers metoprolol en atenolol op het hart te bestuderen?”.

Bètablokkers, zoals metoprolol en atenolol, binden aan de β1‑adrenerge receptor in het cardiovasculair systeem van de mens. Het effect van bètablokkers metoprolol en atenolol zijn in dit eerdere onderzoek bestudeerd, waarna geconcludeerd kon worden dat de bètablokkers voor een verlaging van de hartslag zorgen in Daphnia. Om een volledige conclusie te kunnen trekken dat dit een goede representatie is van het cardiovasculair systeem van de mens, is er een vervolgonderzoek uitgevoerd met als onderzoeksvraag: “Is het β1-adrenerge receptor gen aanwezig in het DNA van Daphnia?”. Dit is onderzocht door middel van een DNA-isolatie en PCR van Daphnia, waarna deze op een agarosegel is gebracht met behulp van elektroforese. Hieruit werd door de DNA-fragmenten tussen de 800 en 1000 bp op de agarosegel geconcludeerd dat Daphnia beschikt over het β1-adrenerge receptor gen.

Om verder te concluderen dat Daphnia een geschikt modelorganisme is voor het cardiovasculair systeem, moet Daphnia dus net als de mens een β1‑adrenerge receptor gen bevatten dat tot expressie komt. Dit toont aan dat het cardiovasculair systeem van Daphnia te vergelijken is met dat van de mens en een geschikt modelorganisme is voor onderzoek naar β1‑gerichte stoffen, zoals bètablokkers metoprolol en atenolol.

Onderzoeksvraag:

Komt het β1-adrenerge receptor gen tot expressie bij Daphnia pulex?

Deelvragen:

  • Dagdeel 3: Kan er uit de Daphnia pulex met de miniprep genoeg cDNA-materiaal worden verkregen voor het succesvol uitvoeren van de PCR?

  • Dagdeel 4: Kan er door middel van een PCR-apparaat cDNA-fragmenten worden gekopieerd, zodat er genoeg cDNA aanwezig is om zichtbaar te zijn op de gel?

  • Dagdeel 5: Kan er aan de hand van de elektroforese op een agarosegel worden aangetoond of het β1‑adrenerge receptor gen van de Daphnia pulex tot expressie komen?

Hypothese:

Er wordt verwacht dat er met behulp van cDNA-synthese, PCR en gelelektroforese aangetoond kan worden dat het aanwezige β1‑adrenerge receptor gen tot expressie komt in Daphnia pulex.

Verwachting:

Er wordt verwacht dat als de hypothese correct is, er op de gel banden verschijnen tussen de 800 – 1000 bp. Hier liggen de gebruikte primers die een deel van de β‑adrenerge receptoren amplificeren.

Materiaal en methode

Dagdeel 3

  • Kan er uit de Daphnia pulex met de miniprep genoeg cDNA-materiaal worden verkregen voor het succesvol uitvoeren van de PCR?

RNA isolatie

Voorbereiding

Twaalf watervlooien zijn overgebracht met behulp van een pasteurpipet in een 1,5 mL epje, waarna het water waarin de watervlooien zich bevonden, is verwijderd met een pipet.

Lyse en homogenisatie

Er is 600 µL RLT-buffer toegevoegd aan het epje met de watervlooien en vervolgens is dit gemengd door te vortexen. De dispergeerder (stand 5) is in het epje geplaatst en is twee keer 10 seconden aangezet om de watervlooien te homogeniseren. Na het homogeniseren is 600 µl 70% ethanol toegevoegd aan het gehomogeniseerde lysaat en is dit gemengd door vijf keer op een neer te pipetteren.

RNA-binding aan de kolom

600 µL van het lysaat werd overgebracht op een RNeasy Mini Spin column. Hierna werd het sample één minuut gecentrifugeerd bij 11.000 g en werd het supernatant verwijderd. Dit is vervolgens herhaald.

Wasstappen

Aan de kolom is 700 µL RW1 buffer toegevoegd, gevolgd door één minuut centrifugeren bij 11.000 g, waarna het supernatant is verwijderd. Vervolgens is 500 μl RPE buffer aan de kolom toegevoegd, gevolgd door één minuut centrifugeren bij 11.000 g, waarna het supernatant is verwijderd. Deze stap is herhaald, maar dan twee minuten centrifugeren bij 11.000 g. De spinkolom is in een nieuw 2 ml opvangtube geplaatst en weer gecentrifugeerd voor één minuut bij 11.000 g.

RNA elutie

De kolom werd in een schoon RNAse-vrij 1,5 mL epje geplaatst, waarna er 100 µL RNase-vrij water direct op het membraan werd gepipetteerd. Dit werd voor één minuut gecentrifugeerd bij 11.000 g.

Bepaling RNA-concentratie

De elutievloeistof in het epje bevatte het geëlueerde RNA. De RNA-concentratie werd bepaald met de Nanodrop.

cDNA synthese

Voorbereiding

Er is een cDNA synthese mengsel gemaakt van een totaalvolume van 12 μl: 500 ng ofwel (500 ng/RNA concentratie=) 3,6 μl RNA van vorig protocol (RNA-isolatie), 1 μl oligo (dT)16 (50uM), 1 μl deoxynucleotiden mix (10 mM per nucleotide) en RNAse-vrij H2O is aangevuld tot een totaalvolume van 12 μl, dit kwam uit op 6,4 μl RNAse-vrij H2O.

Denaturalisatie van RNA en annealing van oligo(dT)

Het mengsel werd geresuspendeerd en geïncubeerd bij 65 °C voor vijf minuten. Na het incuberen werd het mengsel op ijs gebracht en enkele seconden gecentrifugeerd om eventueel gevormd condens naar de bodem van het reactievaatje te brengen.

Reverse-transcriptie en inactivatie

Er werd 4 µl First Strand Synthesis buffer, 2 µl DTT en 1 µl RNase inhibitor toegevoegd en dit werd vervolgens geresuspendeerd. Hierna werd er 1 mL M-MLV reverse-transcriptase toegevoegd en werd er nogmaals geresuspendeerd om het te mengen. Het mengsel werd voor 50 minuten bij 37 °C geïncubeerd. De reactie werd gestopt door te verhitten tot 70°C gedurende 15 minuten. De sample werd bewaard bij -20°C.

Dagdeel 4

  • Kan er door middel van een PCR-apparaat cDNA-fragmenten worden gekopieerd, zodat er genoeg cDNA aanwezig is om zichtbaar te zijn op de gel?

PCR

Voorbereiding PCR

Acht 0,2 mL PCR-epjes werden genummerd van 1 t/m 8:

  1. Bèta 1

  2. Bèta 2

  3. Bèta 3

  4. Actine (positieve controle)

  5. GAPDH (positieve controle)

  6. Bèta 1 (no template control)

  7. Bèta 3 (no template control)

  8. MilliQ-H2O (negatieve controle)

Mastermix

Er werd een Mastermix gemaakt voor zeven van de acht PCR-epjes, waarvan elk epje 20 µL Mastermix bevatte. De Mastermix voor bèta 1 en bèta 3 bevatte in totaal 60 µL uit: 24 µL MilliQ-H2O, 30 µL 2x PCR-buffer, 3 µL betreffende primer fwd en 3 µL betreffende primer rev. De Mastermix voor bèta 2, Actine en GAPDH bevatte in totaal 40 µL uit: 16 µL MilliQ-H2O, 20 µL 2x PCR-buffer, 2 µL betreffende primer fwd en 2 µL betreffende primer rev.

Inhoud PCR-epjes

Elk PCR-epje bevatte 21 µL volume in totaal. Er werd 1 µL Daphnia cDNA gepipetteerd in epjes 1 t/m 5 en 1 µL MilliQ-H2O gepipetteerd in epjes 6 en 7. In epje 8 werd 21 µL MilliQ-H2O gepipetteerd. De PCR-epjes werden enkele seconden afgedraaid in de microcentrifuge. De PCR-epjes werden vervolgens bewaard op ijs.

PCR-programma

De PCR-epjes werden in het PCR-apparaat geplaatst. Het PCR-apparaat werd uitgevoerd met een programma van denaturatie: verhitten naar 94 ˚C en 98 ˚C, gedurende 15-30 seconden; annealing: afkoelen naar 50 ˚C – 65 ˚C, gedurende 15-30 seconden; elongatie: opwarmen naar 72 ˚C, gedurende 1 min/1 kb; 35 cycles van 95°C (30 sec), 56°C (1 min), 72°C (1 min), 72°C (4 min) en 16°C (infinite). De PCR-epjes werden na afloop bij -20 °C bewaard.

Dagdeel 5

  • Kan er aan de hand van de elektroforese op een agarosegel worden aangetoond of de β1‑adrenerge receptoren van de Daphnia pulex tot expressie komen?

Agarose gel elektroforese

Voorbereiding

Er werd een 1% agarosegel bereid, geschikt voor fragmenten van 0,4-13 kb.

Een elektroforese bak, geltray en 20-slots kam werd afgespoeld met kraanwater en weer gedroogd. De open zijkanten van de geltray werden afgeplakt met tape.

Om de gel te maken, werd er 1,0 gram agarose afgewogen. Er werd 50 mL 1× TAE-buffer toegevoegd en gemengd door te zwenken. De agarose werd gesmolten in de magnetron (met de dop losjes). De oplossing werd na borrelen gezwenkt en werd nogmaals in de magnetron geplaatst op 50% power. Na afloop werd er 50 mL TAE-buffer toegevoegd, terwijl de fles rustig werd gezwenkt.

Na afkoelen van de agarose-oplossing werd er 5 μL SYBR-safe aan toegevoegd. De agarose-oplossing werd in de geltray gegoten en de geltray werd geïncubeerd op kamertemperatuur tot de agarose oplossing ging stollen.

TAE-buffer

Vanuit een 50× TAE-stockoplossing werd een 800 mL 1× TAE-buffer bereid door 16 mL 50× TAE met 784 mL demiwater te mengen. De elektroforese bak werd gevuld met TAE-buffer tot 0,5 cm onder vloeistofoppervlak.

Het laden van de monsters

Er werd 5 μl 5× loading buffer en 21 μL cDNA gemengd per monster.

Er werd tweemaal 12,5 μL λ PstI marker op de gel geladen. De marker bevatte 2,5 μL 5× LB en 10 μL λ PstI marker.

De monsters werden geladen volgens een schema met: twee DNA-markers, PCR-bèta 1, PCR-bèta 2, PCR-bèta 3, positieve controle actine, positieve controle GADPH, no template control bèta 1 zonder Daphnia-DNA, no template control bèta 3 zonder Daphnia-DNA en negatieve controle (MilliQ-H2O).

Elektroforese

De gel werd geëlektroforeerd op 120V voor één uur.

Data analyse

Er werd gebruik gemaakt van een imaging-systeem, waar de gel onder Uv-licht werd bekeken. Door de UV-visualisatie kon de data-analyse worden gedaan door het bekijken van de bandgroottes in basenparen.

Resultaten

Dagdeel 3

De concentratie van het geïsoleerde RNA was 7,7 ng/µl.

De concentratie RNA dat werd gebruikt voor de cDNA synthese was 138,8 ng/µl.

Dagdeel 5

Figuur 1: Agarose gel-elektroforese.

Er is 1% agarose gebruikt voor de gel. De slotjes zijn genummerd van 1 t/m 10. De inhoud van de slotjes zijn aangegeven met labels. Context over labels zijn opgenomen in een legenda. Lijnen zijn getrokken door de twee eiwitmarkers en geven de bekende bandgroottes weer. Deze waarden zijn aangegeven aan de rechterkant van de gel. In slotje 1 en 10 bevinden zich de eiwitmarkers.

Legenda

  1. DNA-marker

  2. Bèta 1

  3. Bèta 2

  4. Bèta 3

  5. Positieve controle: Actine

  6. Positieve controle: GADPH

  7. No Template Control: Bèta 1 zonder Daphnia cDNA

  8. No Template Control: Bèta 3 zonder Daphnia cDNA

  9. Negatieve controle: MilliQ-H2O

  10. DNA-marker

In dit onderzoek was het doel om te achterhalen of β1-adrenerge receptoren tot expressie komen in Daphnia pulex, evenals bij de mens, door middel van RNA-isolatie, cDNA synthese, PCR en gelelektroforese. Dit werd gedaan door de cDNA-fragmenten te controleren op aanwezigheid. De bijbehorende bandgroottes van het cDNA voor β1-adrenerge receptoren moeten liggen tussen de 800-1000 bp. Er zijn echter geen bandjes verschenen op de gel waar de PCR-producten waren aangebracht. Zelfs de positieve controles waar cDNA is gekopieerd met actine (laantje 5) en GADPH (laantje 6) tonen geen bandjes. Alleen de markers zijn aanwezig.

Conclusie

De onderzoeksvraag van dit onderzoek luidt als volgt: “Komt het β1-adrenerge receptor gen tot expressie bij Daphnia pulex?”. Om antwoord te geven op deze onderzoeksvraag, is er gebruik gemaakt van een RNA-isolatie, cDNA synthese, PCR en gelelektroforese. Er zijn echter geen valide resultaten opgenomen om deze vraag te beantwoorden door een gebrek aan banden op het gel. De lege laantjes waar de positieve controles waren aangebracht duidden op een lage RNA-concentratie, cDNA concentratie of een foutief PCR-systeem. De afwezigheid van bandjes op de NTC’s en negatieve controle duidt aan dat er geen contaminatie heeft plaatsgevonden, mits deze al door een foutief PCR-systeem zijn uitgebleven.

De verwachting was dat er banden zouden ontstaan rond 800 en 1000 bp, wat zou duiden op genexpressie van het β1-adrenerge receptor gen. Met deze verwachting zou er namelijk geconcludeerd kunnen worden dat Daphnia pulex een geschikt modelorganisme is voor het cardiovasculair systeem van de mens; Daphnia pulex beschikt over het β1-adrenerge receptor gen én deze komt tot expressie, net als bij de mens. Bètablokkers metoprolol en atenolol binden zich aan de β1-adrenerge receptoren en verlagen hiermee de stimulatie van het hart. Dit kan een goed beeld geven van de effecten van bètablokkers metoprolol en atenolol op het cardiovasculair systeem van de mens.

Het antwoord op de onderzoeksvraag: “Komt het β1-adrenerge gen van de Daphnia pulex tot expressie?” is met deze resultaten dus niet te beantwoorden, maar er kan worden geconcludeerd dat Daphnia pulex wel beschikt over het β1-adrenerge gen en een lagere hartslag geeft op bètablokkers metoprolol en atenolol. Helaas is er geen resultaat dat deze ook daadwerkelijk tot expressie komt en zou voor een volledige onderbouwing dit nog eens onderzocht moeten worden.

Discussie

Discussie

Tijdens het isoleren van het RNA van de Daphnia, kwam er uit de Nanodrop een zeer lage concentratie van 7,7 ng/µl. Er werd besloten om niet door te gaan met de verkregen concentratie, omdat er voor een ideale cDNA synthese een minimum van 50 ng werd gegeven volgens de reactieformule. Dit heeft geresulteerd in het gebruiken van materiaal van medestudenten met een concentratie van 138,8 ng/µl RNA. Het cDNA dat hiermee was gesynthetiseerd en gekopieerd gaf geen bandpatroon het agarosegel. Het originele RNA-sample was niet meer aanwezig, waardoor er niet geconcludeerd kon worden of het lag aan de RNA-isolatie van de medestudenten of dat het lag aan de cDNA synthese, PCR en/of gelelektroforese. De medestudenten hadden tevens geen resultaten op het gel, wat de kans op een foutieve RNA-isolatie meer waarschijnlijk maakt. In een vervolgonderzoek zou het uitgangsmateriaal ook op de gel moeten worden gezet.

Vervolgonderzoek

Er is niet aangetoond of er sprake is van de aanwezigheid van de β1-adrenerge receptor in Daphnia. Voor een vervolgonderzoek kan er nogmaals geëxperimenteerd worden om een hogere RNA-concentratie te verkrijgen om volledig aan te kunnen tonen dat Daphnia een goed modelorganisme is op het cardiovasculaire systeem.

Bijlagen

De gebruikte protocollen zijn verkregen via Canvas:

https://canvas.hu.nl/courses/49798/modules/items/1333321