Trong thiết kế vaccine đa epitope, multi-epitope vaccine, hai thành phần thường bị xem là “phụ” nhưng thực ra có vai trò quyết định là adjuvant và linker. Epitope là phần trực tiếp được hệ miễn dịch nhận diện, nhưng nếu chỉ nối nhiều epitope lại với nhau mà không có adjuvant và linker phù hợp, cấu trúc vaccine có thể gặp nhiều vấn đề: tính sinh miễn dịch yếu, xử lý kháng nguyên không hiệu quả, tạo epitope giả tại vị trí nối, gấp cuộn sai, giảm hòa tan, hoặc không kích hoạt đủ tín hiệu miễn dịch bẩm sinh.
Về mặt miễn dịch học, adjuvant giải quyết vấn đề “thiếu tín hiệu nguy hiểm” của vaccine peptide/protein tái tổ hợp, còn linker giải quyết vấn đề “xử lý và giải phóng epitope đúng cách”. Vì vậy, có thể xem adjuvant là thành phần điều hòa cường độ và hướng đáp ứng miễn dịch, còn linker là thành phần điều hòa kiến trúc và quá trình xử lý kháng nguyên của vaccine.
Trong cấu trúc multi-epitope vaccine thường dùng, các thành phần được tổ chức theo logic module: adjuvant – linker – khối epitope MHC-I – linker – khối epitope MHC-II – linker – khối epitope B-cell – helper epitope như PADRE – tag kỹ thuật nếu cần. Cách tổ chức này không phải quy tắc cứng, nhưng là khung thực hành dễ giải thích, dễ mô hình hóa và dễ kiểm định in silico.
Adjuvant là thành phần được thêm vào vaccine nhằm tăng cường hoặc điều chỉnh đáp ứng miễn dịch đối với kháng nguyên. Với vaccine sống giảm độc lực hoặc vaccine toàn tế bào, bản thân tác nhân gây bệnh thường chứa nhiều PAMP, pathogen-associated molecular patterns, nên có thể kích hoạt miễn dịch bẩm sinh. Ngược lại, vaccine peptide, protein tái tổ hợp hoặc multi-epitope vaccine thường chỉ chứa các đoạn kháng nguyên ngắn, ít hoặc không có tín hiệu bẩm sinh, nên thường cần adjuvant để tạo phản ứng miễn dịch đủ mạnh [1].
Trong thiết kế vaccine đa epitope, adjuvant có thể được dùng theo hai cách. Thứ nhất là adjuvant ngoại sinh, ví dụ chất nhũ tương, muối nhôm, CpG hoặc các chất kích thích TLR dùng trong công thức vaccine. Thứ hai là adjuvant tích hợp trong chuỗi, built-in adjuvant, tức là một peptide hoặc protein miễn dịch được gắn trực tiếp vào đầu N hoặc đầu C của construct.
Trong immunoinformatics, built-in adjuvant được dùng rất phổ biến vì dễ mô hình hóa, dễ đưa vào FASTA, có thể đánh giá cùng với toàn bộ construct bằng các công cụ như VaxiJen, AllerTOP, ToxinPred, ProtParam, docking và immune simulation.
Adjuvant hoạt động chủ yếu bằng cách kích hoạt miễn dịch bẩm sinh, innate immunity. Các tế bào trình diện kháng nguyên như dendritic cell, macrophage và monocyte có nhiều thụ thể nhận diện mẫu, pattern recognition receptors, trong đó quan trọng nhất là Toll-like receptors, NOD-like receptors, RIG-I-like receptors và inflammasome-associated pathways.
Khi PRR được kích hoạt, tế bào trình diện kháng nguyên tăng biểu hiện MHC, CD80, CD86, CD40; đồng thời tiết cytokine như IL-12, TNF-α, IFN type I và các chemokine. Các thay đổi này làm tăng khả năng hoạt hóa tế bào T naïve và định hướng đáp ứng miễn dịch thích ứng.
Nghiên cứu kinh điển của Biragyn và cộng sự cho thấy beta-defensin có thể hoạt hóa dendritic cell phụ thuộc TLR4, làm tăng biểu hiện phân tử đồng kích thích và thúc đẩy trưởng thành tế bào tua [2]. Với vaccine ung thư, vai trò của adjuvant còn quan trọng hơn vì nhiều kháng nguyên ung thư là self-antigen hoặc tumor-associated antigen, nên đáp ứng miễn dịch tự nhiên thường yếu do dung nạp miễn dịch và vi môi trường u ức chế miễn dịch [3].
Một adjuvant phù hợp trong vaccine đa epitope cần đạt bốn mục tiêu chính.
Thứ nhất, tăng tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch của construct. Peptide epitope đơn lẻ thường quá ngắn, dễ bị phân hủy và không đủ kích hoạt tế bào trình diện kháng nguyên. Adjuvant giúp làm cho construct dễ được hệ miễn dịch nhận diện hơn.
Thứ hai, định hướng đáp ứng miễn dịch. Vaccine ung thư thường cần ưu tiên đáp ứng Th1 và CTL, cytotoxic T lymphocyte, hơn là chỉ tạo đáp ứng kháng thể. Vì vậy, các adjuvant kích hoạt TLR2, TLR4 hoặc các trục làm tăng IL-12, IFN-γ và cross-presentation thường được ưu tiên.
Thứ ba, hỗ trợ trình diện chéo, cross-presentation. Đây là quá trình kháng nguyên ngoại sinh được đưa vào con đường MHC-I để kích hoạt CD8+ T cell. Với vaccine ung thư, cross-presentation là cơ chế quan trọng để hình thành đáp ứng CTL chống tế bào u.
Thứ tư, vẫn phải bảo đảm tính ổn định và khả năng sản xuất của protein. Một adjuvant quá dài hoặc quá giàu vùng kỵ nước có thể làm tăng instability index, giảm solubility hoặc gây khó khăn khi biểu hiện trong hệ thống tái tổ hợp.
Built-in adjuvant là adjuvant được nối trực tiếp vào chuỗi vaccine. Vị trí thường dùng nhất là N-terminus vì đầu N thuận lợi cho việc tách adjuvant khỏi các khối epitope bằng linker cứng như EAAAK và giúp tạo một module miễn dịch riêng biệt.
Các nhóm built-in adjuvant thường gặp gồm beta-defensin, 50S ribosomal protein L7/L12, RS09, HBHA, flagellin-derived segments và một số peptide có nguồn gốc HMGB1 như HP91. Tuy nhiên, không phải adjuvant nào cũng phù hợp cho mọi construct. Chọn adjuvant phải dựa trên mục tiêu miễn dịch, độ dài construct, chỉ số ổn định, độc tính, dị ứng, khả năng biểu hiện và receptor miễn dịch dự kiến.
Trong nhiều nghiên cứu multi-epitope vaccine, adjuvant được đặt ở N-terminus rồi nối với khối epitope bằng EAAAK; các epitope MHC-I được nối bằng AAY, còn epitope MHC-II được nối bằng GPGPG [6].
Human beta-defensin-2, hBD-2, và human beta-defensin-3, hBD-3, là các peptide cationic thuộc họ antimicrobial peptides. Ngoài vai trò kháng khuẩn, beta-defensin còn có chức năng điều hòa miễn dịch, thu hút tế bào miễn dịch và hoạt hóa dendritic cell.
HBD-2 đã được nghiên cứu như một adjuvant có khả năng tăng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên. Trong mô hình MERS-CoV, HBD-2 gắn với kháng nguyên làm tăng các marker miễn dịch bẩm sinh và tăng đáp ứng kháng thể trung hòa so với kháng nguyên đơn thuần [1].
Trong immunoinformatics, beta-defensin thường được chọn vì có ba ưu điểm: tương đối ngắn, có tính kích thích miễn dịch bẩm sinh, và dễ tích hợp vào đầu N của construct. Một số nghiên cứu vaccine đa epitope đã dùng beta-defensin 45 amino acid ở N-terminus, nối với khối MHC-I bằng EAAAK, các epitope MHC-I bằng AAY và epitope MHC-II bằng GPGPG [6].
Cần diễn giải thận trọng khi nói beta-defensin-3 là “tốt nhất”. Nó không phải adjuvant tốt nhất tuyệt đối trong mọi bối cảnh. Nó là lựa chọn hợp lý khi ưu tiên construct ngắn, tính ổn định, khả năng fuse vào protein tái tổ hợp và định hướng đáp ứng miễn dịch bẩm sinh. Nếu mục tiêu là kích hoạt TLR4 thật mạnh, một số adjuvant có nguồn gốc vi khuẩn như L7/L12 hoặc HBHA có thể được cân nhắc, nhưng chúng thường dài hơn và có thể làm construct kém gọn hơn.
RS09 là một peptide ngắn được mô tả như LPS peptide mimetic và artificial TLR4 agonist. Vì có độ dài ngắn, RS09 thường được dùng khi muốn giảm kích thước construct nhưng vẫn giữ ý tưởng kích hoạt TLR4.
Trong một số nghiên cứu thiết kế vaccine đa epitope, RS09 và PADRE được đưa vào construct thông qua EAAAK; RS09 được mô tả như peptide mô phỏng LPS hoạt động như TLR4 agonist nhân tạo [7].
Ưu điểm của RS09 là ngắn, dễ đưa vào đầu N, ít làm tăng kích thước protein. Nhược điểm là bằng chứng thực nghiệm trực tiếp trong từng loại ung thư cụ thể không mạnh bằng các adjuvant đã được nghiên cứu lâu hơn. Vì vậy, RS09 phù hợp khi thiết kế construct tối giản hoặc khi cần tạo variant so sánh.
50S ribosomal protein L7/L12 có nguồn gốc từ vi khuẩn, thường được dùng trong các thiết kế multi-epitope vaccine như molecular adjuvant để kích thích đáp ứng miễn dịch bẩm sinh. So với beta-defensin, L7/L12 thường dài hơn, nhưng có ưu điểm là kích thích miễn dịch mạnh và đã được sử dụng trong nhiều construct in silico.
Trong vaccine ung thư hoặc vaccine chống tác nhân nhiễm trùng, L7/L12 thường được đặt ở N-terminus và nối với phần epitope bằng EAAAK. Nếu construct đang có L7/L12 và các chỉ số ProtParam, solubility, allergenicity, toxicity đều đạt, thì không bắt buộc phải thay bằng beta-defensin.
Ngược lại, nếu construct quá dài hoặc instability index cao, beta-defensin hoặc RS09 có thể là lựa chọn thay thế để giảm chiều dài và giảm độ phức tạp của cấu trúc.
HBHA, heparin-binding hemagglutinin, là protein bề mặt liên quan Mycobacterium tuberculosis và có thể được dùng như một molecular adjuvant trong thiết kế vaccine. Về lý thuyết, HBHA có thể hỗ trợ đáp ứng miễn dịch qua kích hoạt miễn dịch bẩm sinh và hướng Th1.
Tuy nhiên, HBHA thường dài hơn các peptide adjuvant như RS09 hoặc beta-defensin fragment, nên có thể làm tăng kích thước construct, ảnh hưởng đến độ ổn định, hòa tan và biểu hiện protein.
Vì vậy, HBHA nên được xem là adjuvant thay thế hoặc adjuvant để tạo variant so sánh, không phải lựa chọn bắt buộc nếu construct đã có beta-defensin hoặc L7/L12. Với vaccine đa epitope ung thư dựa trên tumor-associated antigens, nên ưu tiên một adjuvant chính trước, sau đó đánh giá các variant bằng ProtParam, VaxiJen, AllerTOP, ToxinPred, docking và immune simulation.
PADRE, pan-DR epitope, không phải adjuvant bẩm sinh theo nghĩa PRR agonist. PADRE là universal helper T-cell epitope, được thiết kế để gắn với nhiều phân tử HLA-DR phổ biến và tăng đáp ứng CD4+ T helper. Vì vậy, PADRE nên được gọi chính xác là helper epitope hoặc universal HTL epitope, không nên gọi đơn thuần là adjuvant.
Alexander và cộng sự mô tả PADRE là epitope helper T cell được thiết kế để gắn hầu hết HLA-DR phổ biến với ái lực cao và hoạt động như immunogen mạnh [4].
Trong vaccine đa epitope, PADRE có vai trò bổ sung cho adjuvant. Adjuvant kích hoạt miễn dịch bẩm sinh và giúp dendritic cell trưởng thành; PADRE cung cấp tín hiệu CD4+ T-cell help, hỗ trợ CTL, B cell, class switching và memory response. Nghiên cứu của del Guercio và cộng sự cho thấy các cấu trúc peptide tuyến tính ngắn chứa B-cell epitope và PADRE có thể tạo đáp ứng kháng thể mạnh in vivo [5].
Vị trí thường dùng nhất của built-in adjuvant là N-terminus. Lý do là đầu N giúp adjuvant tiếp xúc rõ với môi trường protein, dễ được mô hình hóa như một domain kích thích miễn dịch riêng và dễ tách khỏi khối epitope bằng linker cứng EAAAK.
Một cấu trúc thực hành phổ biến là:
Adjuvant – EAAAK – CTL block – EAAAK – HTL block – EAAAK – B-cell block – PADRE – His6Tuy nhiên, vị trí này không phải luật tuyệt đối. Một số nghiên cứu đặt adjuvant hoặc tag kỹ thuật ở vị trí khác tùy mục tiêu biểu hiện và mô hình hóa. Nếu không có lý do đặc biệt, N-terminus là vị trí dễ giải thích và dễ chuẩn hóa nhất trong báo cáo vaccine đa epitope.
Linker là đoạn amino acid ngắn được dùng để nối các epitope hoặc các domain trong một protein vaccine nhân tạo. Trong multi-epitope vaccine, linker không chỉ là “dấu nối” cơ học mà có ba vai trò: tạo khoảng cách không gian giữa các epitope, hỗ trợ quá trình cắt xử lý kháng nguyên, và giảm nguy cơ tạo epitope mới tại vị trí nối.
Khi nối nhiều epitope liên tiếp, vùng giao nhau giữa hai epitope có thể sinh ra một trình tự mới không tồn tại trong protein gốc. Trình tự này được gọi là junctional epitope hoặc neo-junctional epitope. Nếu peptide tại vùng nối được xử lý và trình diện bởi MHC, nó có thể gây đáp ứng ngoài mục tiêu hoặc cạnh tranh với epitope mong muốn.
Vì vậy, linker phù hợp giúp hệ proteasome, endosome/lysosome hoặc protease nhận diện và cắt construct theo cách dự đoán được hơn.
Có thể chia linker thành ba nhóm chính: linker linh hoạt, linker cứng và linker có chức năng cắt.
Linker linh hoạt, flexible linker, thường giàu glycine và serine, ví dụ GGGGS hoặc GPGPG. Glycine tạo độ linh hoạt vì có mạch bên nhỏ, còn serine giúp tăng tính tan. Linker linh hoạt giúp các epitope hoặc domain di chuyển tương đối độc lập, giảm cản trở không gian.
Linker cứng, rigid linker, điển hình là EAAAK. Linker này có xu hướng tạo alpha-helix, giúp tách hai domain ra xa nhau và giảm tương tác không mong muốn giữa các phần của construct. Vì vậy, EAAAK thường được dùng giữa adjuvant và khối epitope hoặc giữa các block lớn.
Linker có chức năng cắt, cleavable linker, là linker được thiết kế để dễ bị protease nhận diện. AAY thường được dùng giữa các CTL/MHC-I epitope vì liên quan xử lý proteasome; KK được dùng trong một số thiết kế B-cell hoặc để hỗ trợ xử lý trong lysosome; RVRR hoặc RVRRF là motif liên quan furin cleavage nhưng chỉ nên dùng khi có lý do sinh học rõ, không nên thêm thường quy.
AAY, Ala-Ala-Tyr, là linker rất phổ biến để nối các CTL epitope trong khối MHC-I. Lý do chính là MHC-I epitope cần được giải phóng thành peptide ngắn, thường 8–11 amino acid, qua quá trình xử lý protein bởi proteasome.
AAY được dùng nhằm tăng khả năng cắt tại vị trí phù hợp và giảm hình thành junctional epitope. Nhiều nghiên cứu multi-epitope vaccine sử dụng AAY để nối MHC-I epitopes, trong khi GPGPG được dùng cho MHC-II và KK cho B-cell epitopes [7].
Cấu trúc thực hành:
CTL1–AAY–CTL2–AAY–CTL3Không nên dùng GPGPG làm linker chính cho CTL block nếu mục tiêu là mô phỏng xử lý proteasome, vì GPGPG thiên về tính linh hoạt và phù hợp hơn với HTL/MHC-II epitope.
GPGPG, Gly-Pro-Gly-Pro-Gly, là linker thường dùng cho HTL epitope, tức epitope trình diện qua MHC-II. MHC-II epitope thường dài hơn MHC-I, thường khoảng 13–25 amino acid, được xử lý trong endosome/lysosome.
GPGPG giúp tách các epitope CD4+ T-cell, duy trì tính linh hoạt và giảm ảnh hưởng lẫn nhau giữa các đoạn peptide. Trong các nghiên cứu immunoinformatics, GPGPG thường được dùng để nối MHC-II epitopes nhằm tăng tính độc lập của các epitope và hỗ trợ trình diện qua MHC-II [6,7].
Cấu trúc thực hành:
HTL1–GPGPG–HTL2–GPGPG–HTL3GPGPG cũng có thể được dùng để nối PADRE với HTL block vì PADRE bản chất là helper T-cell epitope.
KK, Lys-Lys, là linker ngắn thường dùng để nối B-cell epitopes trong vaccine đa epitope. Về lý thuyết, KK giúp tạo điểm cắt thuận lợi và hỗ trợ xử lý epitope trong lysosome, đồng thời vẫn giữ cấu trúc construct ngắn gọn.
Một số nghiên cứu dùng KK để nối B-cell epitopes, trong khi AAY và GPGPG lần lượt được dùng cho MHC-I và MHC-II epitopes [7].
Cấu trúc thực hành:
BCL1–KK–BCL2–KK–BCL3Nếu B-cell epitope dài hoặc cần giữ độ linh hoạt, GGGGS có thể được cân nhắc thay cho KK. Tuy nhiên, với construct cần gọn và dễ kiểm soát, KK thường là lựa chọn đơn giản hơn.
GGGGS là linker linh hoạt cổ điển, giàu glycine và serine. Linker này không đặc hiệu cho MHC-I hay MHC-II, nhưng hữu ích khi cần tạo độ linh hoạt giữa các domain hoặc giữ epitope bề mặt không bị che khuất.
Trong vaccine đa epitope, GGGGS có thể được dùng cho B-cell epitope hoặc giữa các vùng cần linh hoạt nhưng không nhất thiết cần cắt proteasome.
Nhược điểm của GGGGS là nếu dùng lặp lại quá nhiều, construct có thể trở nên quá linh hoạt, gây khó dự đoán cấu trúc 3D và có thể làm giảm tính ổn định cục bộ. Vì vậy, không nên dùng một loại linker duy nhất cho toàn bộ construct.
EAAAK, Glu-Ala-Ala-Ala-Lys, là linker cứng có xu hướng tạo alpha-helix. Trong multi-epitope vaccine, EAAAK thường được dùng để tách các domain lớn, ví dụ giữa adjuvant và CTL block, giữa CTL và HTL block, hoặc giữa HTL và B-cell block.
Mục tiêu của EAAAK là giảm tương tác không mong muốn giữa các phần có chức năng khác nhau. Một số nghiên cứu vaccine đa epitope dùng EAAAK để nối adjuvant với khối epitope và dùng AAY, GPGPG, KK cho các nhóm epitope tương ứng [6,7].
Cấu trúc thực hành:
Adjuvant–EAAAK–CTL block–EAAAK–HTL block–EAAAK–B-cell blockEAAAK không nên dùng giữa từng epitope nhỏ trong cùng một block, vì nó có thể làm construct dài và quá cứng. Vai trò tốt nhất của EAAAK là tách các module lớn.
Adjuvant và linker phải được chọn cùng nhau, không nên chọn riêng lẻ. Một adjuvant mạnh nhưng nối bằng linker không phù hợp có thể ảnh hưởng gấp cuộn hoặc che khuất epitope. Ngược lại, linker tốt nhưng construct thiếu adjuvant có thể không đủ tín hiệu miễn dịch bẩm sinh.
Một cấu trúc cân bằng thường dùng là:
Adjuvant–EAAAK–[MHC-I epitopes joined by AAY]–EAAAK–[PADRE/HTL epitopes joined by GPGPG]–EAAAK–[B-cell epitopes joined by KK]–His6Tổ hợp này có logic sinh học rõ: EAAAK tách các module lớn, AAY hỗ trợ xử lý MHC-I, GPGPG phù hợp với HTL/MHC-II, KK hoặc GGGGS dùng cho B-cell block, còn PADRE bổ sung tín hiệu helper T-cell.
Không nên dùng một linker duy nhất cho toàn construct vì mỗi nhóm epitope đi theo một con đường xử lý miễn dịch khác nhau.
MHC-I epitope cần tối ưu cho proteasome processing và trình diện qua MHC-I, nên AAY hợp lý hơn.
MHC-II epitope cần xử lý trong endosome/lysosome, có chiều dài lớn hơn và cần CD4+ T-cell recognition, nên GPGPG phù hợp hơn.
B-cell epitope cần tiếp xúc tốt với BCR hoặc giữ tính linh hoạt bề mặt, nên KK hoặc GGGGS thường phù hợp hơn.
Các block lớn cần tách biệt về mặt cấu trúc, nên EAAAK phù hợp hơn. Vì vậy, linker không phải thành phần trang trí mà là yếu tố mã hóa cách construct được cắt, gấp, trình diện và nhận diện.
Lỗi thứ nhất là xem PADRE như adjuvant bẩm sinh. PADRE là universal HTL epitope, không phải TLR agonist. Nó hỗ trợ CD4+ T-cell help, nhưng không thay thế hoàn toàn adjuvant kích hoạt innate immunity.
Lỗi thứ hai là dùng quá nhiều adjuvant. Một construct có beta-defensin, L7/L12, HBHA, RS09 cùng lúc có thể tạo tín hiệu miễn dịch mạnh trên lý thuyết nhưng sẽ dài, khó ổn định, khó biểu hiện và khó diễn giải. Trong giai đoạn thiết kế đầu tiên, nên dùng một adjuvant chính và tạo các variant để so sánh.
Lỗi thứ ba là dùng cùng một linker cho mọi loại epitope. Điều này làm mất logic sinh học của từng con đường MHC-I, MHC-II và B-cell.
Lỗi thứ tư là chọn construct chỉ dựa trên docking score. Docking với TLR hoặc HLA chỉ là một lớp đánh giá. Construct cuối vẫn phải đạt antigenicity, non-allergenicity, non-toxicity, stability, solubility và population coverage.
Lỗi thứ năm là không kiểm tra lại toàn bộ construct sau khi ghép. Một epitope riêng lẻ có thể non-toxic, non-allergen và antigenic, nhưng khi ghép vào chuỗi dài, toàn construct có thể thay đổi tính chất lý hóa, cấu trúc và độ hòa tan.
Với vaccine đa epitope cho ung thư tuyến giáp thể nhú dựa trên các driver genes wild-type như BRAF, RET, NTRK3, HRAS và TP53, khuyến nghị hợp lý là dùng một adjuvant chính có định hướng Th1/CTL, kết hợp PADRE như universal helper epitope, và dùng các linker khác nhau theo từng block.
Khung lý thuyết đề xuất:
N-terminus
Adjuvant chính
EAAAK
MHC-I / CTL block, nối bằng AAY
EAAAK
PADRE + MHC-II / HTL block, nối bằng GPGPG
EAAAK
B-cell block, nối bằng KK hoặc GGGGS
His6-tag nếu cần biểu hiện và tinh sạch protein
C-terminusNếu ưu tiên construct ngắn và ổn định, beta-defensin-3 hoặc beta-defensin fragment là lựa chọn hợp lý. Nếu đã có L7/L12 và construct vẫn đạt ProtParam, solubility, non-toxic, non-allergen, thì L7/L12 vẫn có thể giữ. HBHA nên xem là lựa chọn thay thế để tạo variant, không phải thành phần bắt buộc. PADRE nên được giữ như helper epitope vì lợi ích về CD4+ T-cell help và độ phủ HLA-DR, nhưng cần ghi đúng bản chất là universal HTL epitope.
| Thành phần | Vai trò chính | Vị trí thường dùng | Gợi ý sử dụng |
|---|---|---|---|
| Adjuvant | Kích hoạt miễn dịch bẩm sinh, tăng sinh miễn dịch và định hướng Th1/CTL | N-terminus, nối với EAAAK | Dùng một adjuvant chính; beta-defensin, RS09 hoặc L7/L12 tùy mục tiêu |
| PADRE | Universal HTL epitope, tăng CD4+ T-cell help | Gần HTL block hoặc gần C-terminus | Nên dùng; không gọi là adjuvant bẩm sinh |
| AAY | Hỗ trợ xử lý MHC-I/CTL và giảm junctional epitope | Giữa các CTL epitopes | Dùng cho MHC-I block |
| GPGPG | Tách HTL epitopes, phù hợp MHC-II processing | Giữa các HTL epitopes và PADRE/HTL | Dùng cho MHC-II block |
| KK | Linker ngắn cho B-cell epitopes | Giữa các B-cell epitopes | Dùng khi cần construct gọn |
| GGGGS | Linker linh hoạt, giữ khoảng cách mềm | B-cell block hoặc vùng cần linh hoạt | Dùng thay KK nếu cần tăng linh hoạt |
| EAAAK | Rigid linker, tách các module lớn | Giữa adjuvant và epitope block; giữa các block lớn | Không dùng giữa từng epitope nhỏ |
Adjuvant và linker là hai thành phần nền tảng trong thiết kế vaccine đa epitope. Adjuvant quyết định khả năng vaccine kích hoạt miễn dịch bẩm sinh và định hướng đáp ứng Th1/CTL, đặc biệt quan trọng trong vaccine ung thư vì nhiều kháng nguyên là self-antigen hoặc tumor-associated antigen. Linker quyết định cách các epitope được tách biệt, xử lý, giải phóng và trình diện qua MHC-I, MHC-II hoặc nhận diện bởi B-cell receptor.
Một thiết kế hợp lý không nên hỏi “adjuvant nào tốt nhất tuyệt đối” hoặc “linker nào tốt nhất tuyệt đối”, mà phải hỏi: adjuvant và linker nào phù hợp nhất với mục tiêu miễn dịch, chiều dài construct, độ ổn định, độ hòa tan, khả năng biểu hiện và con đường trình diện kháng nguyên.
Với multi-epitope vaccine cho PTC, tổ hợp có cơ sở nhất là: một adjuvant chính ở N-terminus, EAAAK giữa các block lớn, AAY cho MHC-I, GPGPG cho MHC-II/PADRE, KK hoặc GGGGS cho B-cell epitope, và kiểm tra lại toàn bộ construct sau khi ghép.