1 Bibliotecas Utilizadas

library(knitr)
library(dplyr)
library(ggplot2)
library(tidyr)
library(pheatmap)
library(RColorBrewer)
library(plotly)

2 Teste T

Para realizar a análise estatística de uma amostra como a Turnera, com o objetivo de comparar os compostos orgânicos voláteis (COVs) da folha e da flor, foram definidas, na matriz de dados (previamente processada utilizando o MZmine), duas classes referentes às amostras analisadas em triplicata, sendo elas flor e folha.

Foi utilizado o teste t de Student, uma ferramenta estatística empregada para verificar se existe diferença significativa entre dois grupos, neste caso, as duas classes (flor e folha). Esse teste calcula um valor t com base na diferença entre as médias, na variância e no tamanho das amostras, comparando-o a um valor de p, que é utilizado para aceitar ou rejeitar a hipótese nula. Nos casos em que um composto apresenta valor de p < 0,05, rejeita-se a hipótese nula, admitindo-se que há diferença significativa entre os grupos para esse composto.

dados <- read.csv2("Comparação_TURNERA.csv")

# 1. Transformar Class em fator

dados$Class <- factor(dados$Class)
Class <- dados$Class
sample <- dados$Sample

# 2. Selecionar apenas dados numéricos

dados_numericos <- dados[, -c(1, 2)]

# 3. Converter todas as colunas para numérico

dados_numericos[] <- lapply(dados_numericos, function(x) as.numeric(as.character(x)))

# 4. Normalização z-score 

dados_normalizados <- as.data.frame(scale(dados_numericos))

# 5. Teste t sobre os dados NORMALIZADOS

p_valores <- apply(dados_normalizados, 2, function(coluna) {
  tryCatch(t.test(coluna ~ Class)$p.value, error = function(e) NA)
})

# Filtra apenas resultados significativos (p < 0,05)

resultados_significativos <- p_valores[!is.na(p_valores) & p_valores < 0.05]

# Tabela com composto e p-valor, ordenado os mais significativos

tabela_p_valores <- data.frame(
  Composto = names(resultados_significativos),
  P_Valor  = resultados_significativos,
  row.names = NULL
) %>%
  arrange(P_Valor)

knitr::kable(tabela_p_valores, digits = 4,
             caption = "Compostos com diferença significativa (p < 0,05) — dados normalizados")
Compostos com diferença significativa (p < 0,05) — dados normalizados
Composto P_Valor
Caryophyllene 0.0108
Humulene 0.0112
X4.Hexen.1.ol…Z. 0.0117
beta.Cadinene 0.0159
cis.muurola.3.5.diene 0.0211
Oxirane…1.methylbutyl. 0.0237
Cadina.3.9.diene 0.0373
D.Limonene 0.0472
X3.Carene 0.0481

3 Destaque por Grupo

# 1. Unir Class com dados normalizados

dados_para_media <- cbind(Class = Class, dados_normalizados)

# 2. Calcular médias por grupo (sintaxe atualizada do dplyr)

medias_calculadas <- dados_para_media %>%
  group_by(Class) %>%
  summarise(across(everything(), ~ mean(.x, na.rm = TRUE)))

# 3. Transpor para formato de tabela

nomes_compostos <- colnames(dados_normalizados)
tabela_medias <- as.data.frame(t(medias_calculadas[, -1]))
colnames(tabela_medias) <- medias_calculadas$Class
tabela_medias$Composto <- nomes_compostos

# 4. Tabela final com p-valor e destaque por grupo
tabela_final <- tabela_medias %>%
  mutate(
    P_Valor  = p_valores[Composto],
    Destaque = ifelse(flor > folha, "FLOR", "FOLHA")
  ) %>%
  filter(P_Valor < 0.05) %>%
  arrange(P_Valor) %>%
  select(Composto, flor, folha, P_Valor, Destaque)

rownames(tabela_final) <- NULL

knitr::kable(tabela_final, digits = 4,
             caption = "Área normalizada, p-valor e grupo com maior intensidade")
Área normalizada, p-valor e grupo com maior intensidade
Composto flor folha P_Valor Destaque
Caryophyllene -0.8810 0.8810 0.0108 FOLHA
Humulene -0.8928 0.8928 0.0112 FOLHA
X4.Hexen.1.ol…Z. -0.8919 0.8919 0.0117 FOLHA
beta.Cadinene -0.8846 0.8846 0.0159 FOLHA
cis.muurola.3.5.diene 0.8755 -0.8755 0.0211 FLOR
Oxirane…1.methylbutyl. -0.8711 0.8711 0.0237 FOLHA
Cadina.3.9.diene 0.8483 -0.8483 0.0373 FLOR
D.Limonene 0.8322 -0.8322 0.0472 FLOR
X3.Carene 0.8309 -0.8309 0.0481 FLOR

4 BOX PLOT

Para a visualização dos dados, foram construídos gráficos do tipo boxplot (diagrama de caixas) com o objetivo de representar a distribuição das intensidades normalizadas dos compostos mais significativos. Os gráficos foram gerados separadamente para os compostos com maior destaque em flor e em folha.

No eixo X estão representados os compostos selecionados e no eixo Y as intensidades normalizadas. A mediana, os quartis e os valores extremos permitem visualizar de forma clara as diferenças de distribuição entre as duas classes.

# 1. Compostos significativos separados por grupo de destaque

compostos_flor   <- tabela_final$Composto[tabela_final$Destaque == "FLOR"]
compostos_folha  <- tabela_final$Composto[tabela_final$Destaque == "FOLHA"]

# 2. gerar boxplot

gerar_boxplot <- function(compostos, titulo, grupo_destaque) {
  
  if (length(compostos) == 0) {
    message(paste("Nenhum composto significativo para:", titulo))
    return(invisible(NULL))}
  
  # Transformar para formato longo
  
  dados_long <- dados_normalizados[, compostos, drop = FALSE] %>%
    mutate(Class = Class) %>%
    pivot_longer(cols = -Class, names_to = "Composto", values_to = "Intensidade")
  
  # Remover níveis não usados
  
  dados_long$Class <- droplevels(dados_long$Class)
  
  # Definir cores
  
  cores <- if (grupo_destaque == "FLOR") {
    c("flor" = "#E07B8A", "folha" = "gray70")
  } else {
    c("flor" = "gray70", "folha" = "#6BAE75")
  }
  
  # Gerar gráfico
  
  ggplot(dados_long, aes(x = Composto, y = Intensidade, fill = Class)) +
    geom_boxplot(outlier.shape = 21, outlier.size = 2, alpha = 0.85) +
    scale_fill_manual(values = cores, drop = TRUE) +
    labs(
      title = titulo,
      x     = "Composto",
      y     = "Intensidade normalizada",
      fill  = "Classe"
    ) +
    theme_classic(base_size = 12) +
    theme(
      axis.text.x      = element_text(angle = 45, hjust = 1, size = 9),
      plot.title       = element_text(face = "bold", hjust = 0.5),
      legend.position  = "top",
      legend.title     = element_text(face = "bold"))}

# 3. Gerar os gráficos

gerar_boxplot(compostos_flor,  "Compostos com maior intensidade em FLOR",  "FLOR")

gerar_boxplot(compostos_folha, "Compostos com maior intensidade em FOLHA", "FOLHA")

5 HEATMAP + HCA (significativos)

Outra forma de visualizar as intensidades dos compostos entre as duas classes é por meio de um mapa de calor (heatmap). Essa abordagem pode ser combinada com a análise de agrupamento hierárquico (HCA), permitindo avaliar se as amostras se agrupam de acordo com suas respectivas classes, folha e flor.

# 1. MATRIZ COMPLETA 

matriz_total <- dados_normalizados
rownames(matriz_total) <- sample

# Clustering das amostras 

dist_rows <- dist(matriz_total, method = "euclidean")
hclust_rows <- hclust(dist_rows, method = "ward.D2")

# 2. MATRIZ SIGNIFICATIVA 

compostos_sig <- tabela_final$Composto
matriz_sig <- dados_normalizados[, compostos_sig, drop = FALSE]
rownames(matriz_sig) <- sample

# 3. ANOTAÇÃO

anotacao <- data.frame(Classe = Class)
rownames(anotacao) <- sample

cores_anotacao <- list(
  Classe = c("flor" = "#E07B8A", "folha" = "#6BAE75"))

# 4. CORES HEATMAP

cores_heatmap <- colorRampPalette(
  rev(brewer.pal(n = 7, name = "RdYlBu")))(100)

# 5. HEATMAP FINAL

pheatmap(
  matriz_sig,
  cluster_rows = hclust_rows,
  
# Colunas (compostos)

  clustering_method = "ward.D2",
  clustering_distance_cols = "euclidean",
  
  annotation_row = anotacao,
  annotation_colors = cores_anotacao,
  
  scale = "none",
  color = cores_heatmap,
  
  fontsize = 10,
  fontsize_row = 8,
  fontsize_col = 8,
  
  main = "Heatmap + HCA dos Compostos Significativos")

Com base no heatmap dos compostos significativos, observa-se de forma evidente uma clara distinção entre as amostras das classes folha e flor, em função das diferenças nas intensidades dos compostos. Essa separação é reforçada pela análise de agrupamento hierárquico (HCA), que evidencia a formação de clusters bem definidos, correspondentes a cada uma das classes analisadas.

6 HEATMAP + HCA (todos os compostos)

Também foi construído um heatmap utilizando todos os compostos detectados, com o objetivo de visualizar o perfil geral das amostras, com base na intensidade dos compostos.

# 1. Matriz de dados

matriz_heatmap <- dados_normalizados

# 2. Definir nomes das amostras

rownames(matriz_heatmap) <- sample

# 3. Criar anotação (classe)

anotacao <- data.frame(Classe = Class)
rownames(anotacao) <- sample

# 4. Cores da anotação

cores_anotacao <- list(
  Classe = c("flor" = "#E07B8A", "folha" = "#6BAE75"))

# 5. Paleta de cores do heatmap (melhor contraste)

cores_heatmap <- colorRampPalette(
  rev(brewer.pal(n = 7, name = "RdYlBu")))(100)

# 6. Gerar heatmap + HCA

pheatmap(matriz_heatmap,
  
  # Clustering
  
  clustering_method = "ward.D2",
  clustering_distance_rows = "euclidean",
  clustering_distance_cols = "euclidean",
  
  # Anotações
  
  annotation_row = anotacao,
  annotation_colors = cores_anotacao,
  
  # Aparência
  
  scale = "none",   
  color = cores_heatmap,
  
  fontsize = 10,
  fontsize_row = 8,
  fontsize_col = 6, 
  
  show_colnames = TRUE, 
  
  main = "Heatmap + HCA de Todos os Compostos")

Novamente, foi possível observar uma separação bem definida entre os clusters correspondentes às classes folha e flor. Além disso, as intensidades das áreas apresentaram uma distribuição heterogênea entre as classes, refletindo diferenças no perfil químico das amostras.

7 PCA 3D

A análise de componentes principais (PCA) foi empregada como uma abordagem multivariada com o objetivo de reduzir a dimensionalidade dos dados e identificar padrões de similaridade entre as amostras. Essa técnica permite projetar os dados em um novo espaço de variáveis ortogonais (componentes principais), maximizando a variância explicada. Dessa forma, torna-se possível avaliar a separação entre as classes folha e flor.

A análise de componentes principais (PCA) foi realizada utilizando a biblioteca plotly, que permite a construção de gráficos interativos, possibilitando melhor exploração visual dos dados em três dimensões. Essa abordagem facilita a identificação de padrões e a separação entre as amostras.

Como o conjunto de dados é composto por uma única amostra analisada em triplicata e apresenta um número reduzido de compostos orgânicos voláteis (VOCs), a PCA conseguiu explicar uma elevada proporção da variância total dos dados, atingindo 93,3% nos três primeiros componentes principais (PC1, PC2 e PC3). Esse resultado indica que a maior parte da informação contida nos dados foi capturada nesses eixos.

Além disso, observa-se uma clara separação entre as amostras das classes folha e flor no espaço multivariado, evidenciando diferenças consistentes entre os perfis químicos, mesmo considerando o número limitado de variáveis analisadas.

# PCA

pca_res <- prcomp(dados_normalizados, scale. = FALSE)

# Scores (amostras)

scores <- as.data.frame(pca_res$x)
scores$Class <- Class
scores$Sample <- sample

# Variância explicada

var_exp <- (pca_res$sdev^2 / sum(pca_res$sdev^2)) * 100

# PCA 3D

plot_ly(
  data = scores,
  x = ~PC1,
  y = ~PC2,
  z = ~PC3,
  color = ~Class,
  colors = c("flor" = "#E07B8A", "folha" = "#6BAE75"),
  text = ~Sample,
  type = "scatter3d",
  mode = "markers",
  marker = list(size = 5)
) %>%
  layout(
    title = "PCA 3D das Amostras",
    scene = list(
      xaxis = list(title = paste0("PC1 (", round(var_exp[1],1), "%)")),
      yaxis = list(title = paste0("PC2 (", round(var_exp[2],1), "%)")),
      zaxis = list(title = paste0("PC3 (", round(var_exp[3],1), "%)"))))