CD4 T Cell Reference Trajectory — Monocle3 vs Custom MST

Dual trajectory comparison | Milestone annotation | Sézary projection

knitr::opts_chunk$set(
  echo      = TRUE,
  message   = FALSE,
  warning   = FALSE,
  fig.align = "center",
  dpi       = 150
)

---

1 Overview

1.1 Approach

This document implements and compares two trajectory methods for normal CD4 T cells, then projects Sézary syndrome CD4 T cells onto both reference trajectories.

1.1.1 Method 1 — Custom MST (Burel et al. 2022 approach)

• Over-cluster within each annotated state → define milestones (M00–M07)
• Compute Minimum Spanning Tree on milestone centroids in UMAP space
• Project each cell onto nearest MST edge → pseudotime

1.1.2 Method 2 — Monocle3

• Convert Seurat object → cell_data_set
• learn_graph() fits principal graph to data topology
• order_cells() rooted at CD4 Naive centroid → pseudotime
• graph_test() identifies trajectory-variable genes

1.1.3 Comparison

• Spearman correlation between pseudotimes
• Agreement on cell ordering per state
• Concordance on Sézary cell positioning

1.2 Key Objects

Object	Description	Required columns
cd4_ref	Annotated normal CD4 T cells	$predicted.celltype.l2, UMAP, RNA
sezary_obj	Sézary CD4 T cells	RNA (normalised), optional ADT

1.3 Packages Required

install.packages(c("igraph","RANN","ggrepel","patchwork","pheatmap","viridis"))
BiocManager::install("monocle3")
remotes::install_github("satijalab/seurat-wrappers")

---

2 Setup

suppressPackageStartupMessages({
  library(Seurat)
  library(SeuratWrappers)
  library(monocle3)
  library(igraph)
  library(RANN)
  library(ggplot2)
  library(ggrepel)
  library(dplyr)
  library(tidyr)
  library(patchwork)
  library(pheatmap)
  library(viridis)
  library(scales)
  library(RColorBrewer)
  library(knitr)
  library(kableExtra)
})

STATE_COLORS <- c(
  "CD4 Naive"     = "#4472C4",
  "CD4 TCM"       = "#70AD47",
  "CD4 TEM"       = "#ED7D31",
  "CD4 Temra/CTL" = "#C00000",
  "Treg"          = "#7030A0"
)

METHOD_COLORS <- c(
  "Monocle3"   = "#e74c3c",
  "Custom MST" = "#2980b9"
)

STATE_ORDER <- c("CD4 Naive","CD4 TCM","CD4 TEM","CD4 Temra/CTL","Treg")

UMAP_NAME <- "umap"
STATE_COL <- "predicted.celltype.l2"

# BIOINFORMATICIAN NOTE on resolutions:
# Dotplot showed M03 was TCM-like (LTB+/IL7R+, no effector markers) —
# this means resolution 0.08 for TCM was still too high, producing 3 TCM
# milestones instead of 2. Reducing to 0.05 collapses the third TCM milestone
# so the sub-clustering yields exactly 2 TCM milestones (early and late).
# TEM resolution increased to 0.30 to better separate TEM from Temra.
MILESTONE_RES <- c(
  "CD4 Naive"     = 0.05,   # CHANGED 0.10→0.05: single homogeneous milestone
  "CD4 TCM"       = 0.06,   # CHANGED 0.08→0.05: was producing 3 milestones, need 2
  "CD4 TEM"       = 0.05,   # CHANGED 0.20→0.30: better separation of TEM vs Temra
  "CD4 Temra/CTL" = 0.10,   # unchanged — single milestone (only 10 cells)
  "Treg"          = 0.20    # unchanged — 2 milestones (naive + terminal)
)

cat("✓ Setup complete\n")

✓ Setup complete

cat("\nState colours:\n");        print(STATE_COLORS)

State colours:
    CD4 Naive       CD4 TCM       CD4 TEM CD4 Temra/CTL          Treg 
    "#4472C4"     "#70AD47"     "#ED7D31"     "#C00000"     "#7030A0" 

cat("\nMilestone resolutions:\n"); print(MILESTONE_RES)

Milestone resolutions:
    CD4 Naive       CD4 TCM       CD4 TEM CD4 Temra/CTL          Treg 
         0.05          0.06          0.05          0.10          0.20 

cat("\nState column:", STATE_COL, "\n")

State column: predicted.celltype.l2 

cat("UMAP name:   ", UMAP_NAME,  "\n")

UMAP name:    umap 

---

3 Load & Validate Objects

cat("CD4 reference loaded:", ncol(cd4_ref),    "cells\n")

CD4 reference loaded: 11466 cells

cat("Sezary object loaded:", ncol(sezary_obj), "cells\n")

Sezary object loaded: 49305 cells

cat("\nAzimuth l2 labels present:\n")

Azimuth l2 labels present:

print(table(cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]]))

    CD4 Naive       CD4 TCM       CD4 TEM CD4 Temra/CTL          Treg 
         2037          9067           145            10           207 

stopifnot(
  "predicted.celltype.l2 missing from cd4_ref" = STATE_COL %in% colnames(cd4_ref@meta.data),
  "UMAP missing from cd4_ref"                  = UMAP_NAME %in% names(cd4_ref@reductions),
  "RNA assay missing from cd4_ref"             = "RNA" %in% names(cd4_ref@assays),
  "RNA assay missing from sezary_obj"          = "RNA" %in% names(sezary_obj@assays)
)
cat("✅ Validation passed\n")

✅ Validation passed

DefaultAssay(cd4_ref)    <- "RNA"
DefaultAssay(sezary_obj) <- "RNA"

cd4_states_keep <- names(MILESTONE_RES)
cells_keep      <- cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]] %in% cd4_states_keep
if (sum(!cells_keep) > 0) {
  cd4_ref <- subset(cd4_ref, cells = colnames(cd4_ref)[cells_keep])
  cat("Subsetted to trajectory states:", ncol(cd4_ref), "cells\n")
}

umap_df           <- as.data.frame(Embeddings(cd4_ref, UMAP_NAME))
colnames(umap_df) <- c("UMAP_1","UMAP_2")
umap_df$cell      <- rownames(umap_df)
umap_df$state     <- cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]]

ref_summary <- cd4_ref@meta.data %>%
  count(!!sym(STATE_COL), name = "n_cells") %>%
  rename(State = !!sym(STATE_COL)) %>%
  mutate(pct = round(100 * n_cells / sum(n_cells), 1)) %>%
  arrange(match(State, STATE_ORDER))

kable(ref_summary,
      caption = sprintf("Reference CD4 T cells (n = %d total)", ncol(cd4_ref))) %>%
  kable_styling(bootstrap_options = c("striped","hover"), full_width = FALSE)

Reference CD4 T cells (n = 11466 total)

State	n_cells	pct
CD4 Naive	2037	17.8
CD4 TCM	9067	79.1
CD4 TEM	145	1.3
CD4 Temra/CTL	10	0.1
Treg	207	1.8

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4 Define Milestones (Shared by Both Methods)

4.1 Sub-clustering

set.seed(42)
cd4_ref@meta.data$milestone <- NA_character_
milestone_counter           <- 0L
milestone_state_map         <- list()

states_present <- intersect(names(MILESTONE_RES),
                             unique(cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]]))

cat("Defining milestones by sub-clustering within each state:\n\n")

Defining milestones by sub-clustering within each state:

for (st in states_present) {
  cells_st <- colnames(cd4_ref)[cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]] == st]

  if (length(cells_st) < 50) {
    m_id <- sprintf("M%02d", milestone_counter)
    cd4_ref@meta.data$milestone[colnames(cd4_ref) %in% cells_st] <- m_id
    milestone_state_map[[m_id]] <- st
    milestone_counter <- milestone_counter + 1L
    cat(sprintf("  %-20s  %4d cells  →  1 milestone (%s) [too few]\n",
                st, length(cells_st), m_id))
    next
  }

  sub_obj <- subset(cd4_ref, cells = cells_st)

  sub_obj <- FindNeighbors(
    sub_obj,
    reduction  = "pca",
    dims       = 1:20,
    k.param    = 20,
    graph.name = c("sub_nn","sub_snn"),
    verbose    = FALSE
  )

  sub_obj <- FindClusters(
    sub_obj,
    graph.name  = "sub_snn",
    resolution  = MILESTONE_RES[st],
    random.seed = 42,
    verbose     = FALSE
  )

  sub_clusters <- as.character(sub_obj$seurat_clusters)
  n_sub        <- length(unique(sub_clusters))

  for (sc in sort(unique(sub_clusters))) {
    m_id     <- sprintf("M%02d", milestone_counter)
    sc_cells <- cells_st[sub_clusters == sc]
    cd4_ref@meta.data$milestone[colnames(cd4_ref) %in% sc_cells] <- m_id
    milestone_state_map[[m_id]] <- st
    milestone_counter <- milestone_counter + 1L
  }

  cat(sprintf("  %-20s  %4d cells  →  %d milestones (M%02d–M%02d)\n",
              st, length(cells_st), n_sub,
              milestone_counter - n_sub, milestone_counter - 1))
}

  CD4 Naive             2037 cells  →  1 milestones (M00–M00)
  CD4 TCM               9067 cells  →  2 milestones (M01–M02)
  CD4 TEM                145 cells  →  1 milestones (M03–M03)
  CD4 Temra/CTL           10 cells  →  1 milestone (M04) [too few]
  Treg                   207 cells  →  2 milestones (M05–M06)

cat(sprintf("\nTotal milestones: %d\n", milestone_counter))

Total milestones: 7

cat("\nMilestone distribution:\n")

Milestone distribution:

print(table(cd4_ref@meta.data$milestone, useNA = "ifany"))

 M00  M01  M02  M03  M04  M05  M06 
2037 4717 4350  145   10  146   61 

4.2 Milestone Centroids

umap_df$milestone <- cd4_ref@meta.data$milestone

milestone_centroids <- umap_df %>%
  filter(!is.na(milestone)) %>%
  group_by(milestone) %>%
  summarise(
    UMAP_1  = mean(UMAP_1),
    UMAP_2  = mean(UMAP_2),
    n_cells = n(),
    state   = dplyr::first(state),
    .groups = "drop"
  ) %>%
  mutate(state = unlist(milestone_state_map[milestone])) %>%
  arrange(milestone)

cat("Milestone centroids — inspect before setting manual edges:\n")

Milestone centroids — inspect before setting manual edges:

print(milestone_centroids[, c("milestone","state","UMAP_1","UMAP_2","n_cells")])

kable(milestone_centroids,
      caption = "Milestone centroids in UMAP space",
      digits  = 3) %>%
  kable_styling(bootstrap_options = c("striped","condensed"), full_width = FALSE)

Milestone centroids in UMAP space

milestone	UMAP_1	UMAP_2	n_cells	state
M00	-3.437	-0.644	2037	CD4 Naive
M01	3.267	0.287	4717	CD4 TCM
M02	-2.250	-0.166	4350	CD4 TCM
M03	6.521	-0.373	145	CD4 TEM
M04	6.944	-0.262	10	CD4 Temra/CTL
M05	1.124	3.371	146	Treg
M06	3.276	3.962	61	Treg

---

5 Method 1 — Custom MST Trajectory

Custom MST approach (Burel et al. 2022): connects milestone centroids with a Minimum Spanning Tree; cells get pseudotime by projection onto nearest edge.

5.1 MST Computation

# ── Step 1: Distance matrix ────────────────────────────────────────────────
centroid_mat <- as.matrix(milestone_centroids[, c("UMAP_1","UMAP_2")])
rownames(centroid_mat) <- milestone_centroids$milestone
dist_mat <- as.matrix(dist(centroid_mat, method = "euclidean"))

# ── Step 2: Root = CD4 Naive ──────────────────────────────────────────────
tn_milestones <- milestone_centroids$milestone[milestone_centroids$state == "CD4 Naive"]
cat("CD4 Naive milestones:", tn_milestones, "\n")

CD4 Naive milestones: M00 

if (length(tn_milestones) == 1) {
  root_ms <- tn_milestones
} else {
  tn_centroid <- colMeans(centroid_mat[tn_milestones, , drop = FALSE])
  tn_dists    <- rowSums((centroid_mat[tn_milestones, , drop = FALSE] -
                   matrix(tn_centroid, nrow=length(tn_milestones), ncol=2, byrow=TRUE))^2)
  root_ms <- tn_milestones[which.min(tn_dists)]
}
cat("Root milestone:", root_ms, "\n")

Root milestone: M00 

# ── Step 3: Automatic MST — inspect only ──────────────────────────────────
g_auto   <- graph_from_adjacency_matrix(dist_mat, mode="undirected",
                                        weighted=TRUE, diag=FALSE)
mst_auto <- mst(g_auto, algorithm="prim")
cat("\nAutomatic MST (reference only):\n")

Automatic MST (reference only):

auto_edges <- as_edgelist(mst_auto)
for (i in seq_len(nrow(auto_edges))) {
  s1 <- milestone_centroids$state[milestone_centroids$milestone == auto_edges[i,1]]
  s2 <- milestone_centroids$state[milestone_centroids$milestone == auto_edges[i,2]]
  cat(sprintf("  %s(%s) — %s(%s)\n", auto_edges[i,1], s1, auto_edges[i,2], s2))
}

  M00(CD4 Naive) — M02(CD4 TCM)
  M01(CD4 TCM) — M03(CD4 TEM)
  M01(CD4 TCM) — M06(Treg)
  M02(CD4 TCM) — M05(Treg)
  M03(CD4 TEM) — M04(CD4 Temra/CTL)
  M05(Treg) — M06(Treg)

# ── Step 4: Build edgelist via state lookup ────────────────────────────────
ms_by_state <- function(state_name, rank = 1) {
  candidates <- milestone_centroids[milestone_centroids$state == state_name, ]
  if (nrow(candidates) < rank) stop(sprintf(
    "State '%s' has only %d milestone(s), but rank=%d was requested.",
    state_name, nrow(candidates), rank))
  candidates <- candidates[order(candidates$UMAP_1), ]
  candidates$milestone[rank]
}

naive_ms  <- ms_by_state("CD4 Naive",     1)
tcm_e_ms  <- ms_by_state("CD4 TCM",       1)
tcm_l_ms  <- ms_by_state("CD4 TCM",       2)
tem_ms    <- ms_by_state("CD4 TEM",       1)  # single TEM milestone
temra_ms  <- ms_by_state("CD4 Temra/CTL", 1)
treg_n_ms <- ms_by_state("Treg",          1)
treg_t_ms <- ms_by_state("Treg",          2)

cat("\nState-to-Current-ID mapping:\n")

State-to-Current-ID mapping:

cat(sprintf("  Naive: %s\n  TCM:   %s(early), %s(late)\n", naive_ms, tcm_e_ms, tcm_l_ms))

  Naive: M00
  TCM:   M02(early), M01(late)

cat(sprintf("  TEM:   %s\n  Temra: %s\n", tem_ms, temra_ms))

  TEM:   M03
  Temra: M04

cat(sprintf("  Treg:  %s(naive), %s(terminal)\n", treg_n_ms, treg_t_ms))

  Treg:  M05(naive), M06(terminal)

edge_list_ordered <- matrix(c(
  naive_ms,  tcm_e_ms,
  tcm_e_ms,  tcm_l_ms,
  tcm_l_ms,  tem_ms,
  tem_ms,    temra_ms,
  tcm_l_ms,  treg_n_ms,
  treg_n_ms, treg_t_ms
), ncol = 2, byrow = TRUE)

# ── Step 5: Explicit traversal order ──────────────────────────────────────
bfs_order_clean <- unique(as.vector(t(edge_list_ordered)))
cat("\nTraversal order:", paste(bfs_order_clean, collapse=" → "), "\n")

Traversal order: M00 → M02 → M01 → M03 → M04 → M05 → M06 

stopifnot(
  "Must have 7 milestones" = length(bfs_order_clean) == 7,
  "Naive must be root"     = bfs_order_clean[1] == naive_ms,
  "Temra before Treg"      = which(bfs_order_clean==temra_ms) < which(bfs_order_clean==treg_n_ms)
)
cat("✅ Traversal order validated\n")

✅ Traversal order validated

# ── Validate edge weights ──────────────────────────────────────────────────
edge_weights <- apply(edge_list_ordered, 1, function(e) dist_mat[e[1], e[2]])
if (any(!is.finite(edge_weights))) {
  bad <- which(!is.finite(edge_weights))
  print(data.frame(from=edge_list_ordered[bad,1],
                   to  =edge_list_ordered[bad,2],
                   w   =edge_weights[bad]))
  stop("NaN/NA/Inf edge weights detected — check state lookup or dist_mat rownames.")
}

mst_graph <- graph_from_edgelist(edge_list_ordered, directed = FALSE)
E(mst_graph)$weight <- edge_weights

cat("\nManual edges defined:\n")

Manual edges defined:

for (i in seq_len(nrow(edge_list_ordered))) {
  sf <- milestone_centroids$state[milestone_centroids$milestone == edge_list_ordered[i,1]]
  st <- milestone_centroids$state[milestone_centroids$milestone == edge_list_ordered[i,2]]
  cat(sprintf("  %s(%s) → %s(%s)  w=%.4f\n",
              edge_list_ordered[i,1], sf, edge_list_ordered[i,2], st, edge_weights[i]))
}

  M00(CD4 Naive) → M02(CD4 TCM)  w=1.2794
  M02(CD4 TCM) → M01(CD4 TCM)  w=5.5349
  M01(CD4 TCM) → M03(CD4 TEM)  w=3.3207
  M03(CD4 TEM) → M04(CD4 Temra/CTL)  w=0.4376
  M01(CD4 TCM) → M05(Treg)  w=3.7556
  M05(Treg) → M06(Treg)  w=2.2321

# ── Step 6: Rename to M00-M06 ─────────────────────────────────────────────
old_to_new <- setNames(sprintf("M%02d", seq_along(bfs_order_clean) - 1L), bfs_order_clean)

cat("\nRenaming map:\n")

Renaming map:

for (o in names(old_to_new)) {
  st <- milestone_centroids$state[milestone_centroids$milestone == o]
  cat(sprintf("  %s (%s) → %s\n", o, st, old_to_new[o]))
}

  M00 (CD4 Naive) → M00
  M02 (CD4 TCM) → M01
  M01 (CD4 TCM) → M02
  M03 (CD4 TEM) → M03
  M04 (CD4 Temra/CTL) → M04
  M05 (Treg) → M05
  M06 (Treg) → M06

milestone_centroids$milestone <- old_to_new[milestone_centroids$milestone]
cd4_ref@meta.data$milestone   <- unname(old_to_new[cd4_ref@meta.data$milestone])
names(milestone_state_map)    <- old_to_new[names(milestone_state_map)]
rownames(centroid_mat)        <- old_to_new[rownames(centroid_mat)]
rownames(dist_mat)            <- old_to_new[rownames(dist_mat)]
colnames(dist_mat)            <- old_to_new[colnames(dist_mat)]
V(mst_graph)$name             <- unname(old_to_new[V(mst_graph)$name])
cat("✅ Renaming applied\n")

✅ Renaming applied

# ── Step 7: Verify final biology ──────────────────────────────────────────
milestone_order <- sprintf("M%02d", seq_len(nrow(milestone_centroids)) - 1L)
cat("\nFinal milestone → biology:\n")

Final milestone → biology:

for (m in milestone_order) {
  st <- milestone_centroids$state[milestone_centroids$milestone == m]
  nc <- milestone_centroids$n_cells[milestone_centroids$milestone == m]
  cat(sprintf("  %s = %-20s  n=%4d\n", m, st, nc))
}

  M00 = CD4 Naive             n=2037
  M01 = CD4 TCM               n=4350
  M02 = CD4 TCM               n=4717
  M03 = CD4 TEM               n= 145
  M04 = CD4 Temra/CTL         n=  10
  M05 = Treg                  n= 146
  M06 = Treg                  n=  61

cat("Expected:\n  M00=Naive  M01/M02=TCM  M03=TEM  M04=Temra  M05/M06=Treg\n")

Expected:
  M00=Naive  M01/M02=TCM  M03=TEM  M04=Temra  M05/M06=Treg

# ── Swap helper ────────────────────────────────────────────────────────────
swap_ms <- function(a, b) {
  tmp <- "__TMP__"
  vn <- V(mst_graph)$name
  vn[vn==a] <- tmp; vn[vn==b] <- a; vn[vn==tmp] <- b; V(mst_graph)$name <<- vn
  mc <- milestone_centroids$milestone
  mc[mc==a] <- tmp; mc[mc==b] <- a; mc[mc==tmp] <- b; milestone_centroids$milestone <<- mc
  mv <- cd4_ref@meta.data$milestone
  mv[!is.na(mv)&mv==a] <- tmp; mv[!is.na(mv)&mv==b] <- a
  mv[!is.na(mv)&mv==tmp] <- b; cd4_ref@meta.data$milestone <<- mv
  nm <- names(milestone_state_map)
  nm[nm==a] <- tmp; nm[nm==b] <- a; nm[nm==tmp] <- b; names(milestone_state_map) <<- nm
  rn <- rownames(centroid_mat)
  rn[rn==a] <- tmp; rn[rn==b] <- a; rn[rn==tmp] <- b; rownames(centroid_mat) <<- rn
  rn <- rownames(dist_mat); cn <- colnames(dist_mat)
  rn[rn==a] <- tmp; rn[rn==b] <- a; rn[rn==tmp] <- b; rownames(dist_mat) <<- rn
  cn[cn==a] <- tmp; cn[cn==b] <- a; cn[cn==tmp] <- b; colnames(dist_mat) <<- cn
  cat(sprintf("  Swapped %s <-> %s\n", a, b))
}
 #swap_ms("M01","M02")  # TCM early/late reversed?
# swap_ms("M05","M06")  # Treg naive/terminal reversed?

# ── Step 8: Graph distances ────────────────────────────────────────────────
graph_dists <- distances(mst_graph, v = "M00", weights = NA)
graph_dists[is.infinite(graph_dists)] <- max(graph_dists[is.finite(graph_dists)]) + 1

milestone_centroids$graph_dist <- as.numeric(graph_dists[, milestone_centroids$milestone])
milestone_centroids$order_pos  <- match(milestone_centroids$milestone, milestone_order)
milestone_centroids             <- arrange(milestone_centroids, order_pos)

# ── Step 9: Edge data frame for plotting ──────────────────────────────────
mst_edges   <- as_edgelist(mst_graph)
mst_edge_df <- do.call(rbind, lapply(seq_len(nrow(mst_edges)), function(i) {
  m1 <- mst_edges[i,1]; m2 <- mst_edges[i,2]
  r1 <- milestone_centroids[milestone_centroids$milestone == m1, ]
  r2 <- milestone_centroids[milestone_centroids$milestone == m2, ]
  if (nrow(r1)==0 || nrow(r2)==0) return(NULL)
  data.frame(x1=r1$UMAP_1, y1=r1$UMAP_2, x2=r2$UMAP_1, y2=r2$UMAP_2)
}))

# ── Final summary ──────────────────────────────────────────────────────────
cat(sprintf("\nFinal MST: %d nodes, %d edges | Root: M00\n",
            vcount(mst_graph), ecount(mst_graph)))

Final MST: 7 nodes, 6 edges | Root: M00

mst_edges_final <- as_edgelist(mst_graph)
for (i in seq_len(nrow(mst_edges_final))) {
  s1 <- milestone_centroids$state[milestone_centroids$milestone == mst_edges_final[i,1]]
  s2 <- milestone_centroids$state[milestone_centroids$milestone == mst_edges_final[i,2]]
  cat(sprintf("  %s (%s) → %s (%s)\n", mst_edges_final[i,1], s1, mst_edges_final[i,2], s2))
}

  M00 (CD4 Naive) → M01 (CD4 TCM)
  M01 (CD4 TCM) → M02 (CD4 TCM)
  M02 (CD4 TCM) → M03 (CD4 TEM)
  M03 (CD4 TEM) → M04 (CD4 Temra/CTL)
  M02 (CD4 TCM) → M05 (Treg)
  M05 (Treg) → M06 (Treg)

5.2 Pseudotime Projection

project_onto_mst <- function(cell_coords, centroid_mat, mst_graph, graph_dists) {
  edges      <- as_edgelist(mst_graph)
  n_cells    <- nrow(cell_coords)
  pseudotime <- numeric(n_cells)
  nearest_ms <- character(n_cells)

  for (i in seq_len(n_cells)) {
    cx <- cell_coords[i, 1]; cy <- cell_coords[i, 2]
    best_dist <- Inf; best_pt <- 0; best_ms <- NA_character_

    for (e in seq_len(nrow(edges))) {
      m1 <- edges[e,1]; m2 <- edges[e,2]
      p1 <- centroid_mat[m1,]; p2 <- centroid_mat[m2,]
      dx <- p2[1]-p1[1]; dy <- p2[2]-p1[2]
      len2 <- dx^2 + dy^2
      if (len2 < 1e-10) next
      t    <- max(0, min(1, ((cx-p1[1])*dx + (cy-p1[2])*dy) / len2))
      proj <- c(p1[1]+t*dx, p1[2]+t*dy)
      d    <- sqrt((cx-proj[1])^2 + (cy-proj[2])^2)
      if (d < best_dist) {
        best_dist <- d
        pt_m1     <- graph_dists[m1]
        pt_m2     <- graph_dists[m2]
        best_pt   <- pt_m1 + t * (pt_m2 - pt_m1)
        best_ms   <- if (t < 0.5) m1 else m2
      }
    }
    pseudotime[i] <- best_pt
    nearest_ms[i] <- best_ms
  }
  list(pseudotime = pseudotime, nearest_ms = nearest_ms)
}

cell_coords <- as.matrix(umap_df[colnames(cd4_ref), c("UMAP_1","UMAP_2")])
g_dists_vec <- setNames(as.numeric(graph_dists), colnames(graph_dists))

cat("Projecting reference cells onto MST...\n")

Projecting reference cells onto MST...

mst_proj <- project_onto_mst(cell_coords, centroid_mat, mst_graph, g_dists_vec)

mst_pt_raw   <- mst_proj$pseudotime
mst_pt_range <- range(mst_pt_raw, na.rm = TRUE)

meta <- cd4_ref@meta.data
meta$mst_pseudotime      <- mst_pt_raw
meta$mst_pseudotime_norm <- 100 * (mst_pt_raw - mst_pt_range[1]) /
                                   (mst_pt_range[2] - mst_pt_range[1])
meta$nearest_milestone   <- mst_proj$nearest_ms
cd4_ref@meta.data        <- meta

cat(sprintf("MST pseudotime range: %.3f – %.3f\n",
            mst_pt_range[1], mst_pt_range[2]))

MST pseudotime range: 0.000 – 4.000

# Validate: median pseudotime should increase along trajectory
cat("\nMedian pseudotime per state (should increase Naive→TCM→TEM→Temra):\n")

Median pseudotime per state (should increase Naive→TCM→TEM→Temra):

pt_check <- cd4_ref@meta.data %>%
  group_by(!!sym(STATE_COL)) %>%
  summarise(median_pt = round(median(mst_pseudotime_norm, na.rm=TRUE), 1),
            .groups="drop") %>%
  arrange(median_pt)
print(pt_check)

5.3 Visualisation

ms_plot <- milestone_centroids %>% mutate(x = order_pos, y = 0)

state_bands <- ms_plot %>%
  group_by(state) %>%
  summarise(xmin = min(x)-.4, xmax = max(x)+.4, .groups="drop") %>%
  mutate(ymin=-.35, ymax=-.15, fill=STATE_COLORS[state])

edge_linear <- do.call(rbind, lapply(seq_len(nrow(mst_edges)), function(i) {
  m1<-mst_edges[i,1]; m2<-mst_edges[i,2]
  r1<-ms_plot[ms_plot$milestone==m1,]; r2<-ms_plot[ms_plot$milestone==m2,]
  if(nrow(r1)==0||nrow(r2)==0) return(NULL)
  data.frame(x1=r1$x,y1=r1$y,x2=r2$x,y2=r2$y)
}))

# ── Panel a: Linear milestone trajectory ──────────────────────────────────
p_mst_linear <- ggplot() +
  geom_rect(data=state_bands,
            aes(xmin=xmin,xmax=xmax,ymin=ymin,ymax=ymax,fill=state), alpha=.85) +
  geom_text(data=state_bands,
            aes(x=(xmin+xmax)/2, y=(ymin+ymax)/2, label=state),
            colour="white", size=3.5, fontface="bold") +
  geom_segment(data=edge_linear,
               aes(x=x1,y=y1,xend=x2,yend=y2),
               colour="grey35", linewidth=1.3, lineend="round") +
  geom_text(data=ms_plot,
            aes(x=x, y=y+0.18, label=paste0("n=", scales::comma(n_cells))),
            size=3, colour="grey10", fontface="bold", vjust=0) +
  geom_point(data=ms_plot, aes(x=x, y=y, fill=state),
             shape=21, colour="white", stroke=2, size=12) +
  geom_text(data=ms_plot, aes(x=x, y=y, label=milestone),
            size=3.2, colour="white", fontface="bold") +
  scale_fill_manual(values=STATE_COLORS, name="State") +
  coord_cartesian(ylim=c(-.5, 0.45)) +
  theme_void() +
  theme(legend.position = "right",
        legend.title    = element_text(size=10, face="bold"),
        legend.text     = element_text(size=9),
        plot.title      = element_text(size=13, face="bold", hjust=.5),
        plot.margin     = margin(15, 10, 10, 10)) +
  ggtitle("Custom MST — Milestones Trajectory")

# ── Panel b: Milestones on UMAP ───────────────────────────────────────────
p_mst_umap_ms <- ggplot() +
  geom_point(data=umap_df[sample(nrow(umap_df)),],
             aes(x=UMAP_1,y=UMAP_2,colour=state), size=.35, alpha=.5) +
  geom_segment(data=mst_edge_df,
               aes(x=x1,y=y1,xend=x2,yend=y2),
               colour="black", linewidth=1, alpha=.85, lineend="round") +
  geom_point(data=milestone_centroids,
             aes(x=UMAP_1,y=UMAP_2,fill=state),
             shape=21, size=8, colour="white", stroke=2) +
  geom_text_repel(data=milestone_centroids,
                  aes(x=UMAP_1,y=UMAP_2,label=milestone),
                  size=3, colour="white", fontface="bold",
                  bg.color="grey20", bg.r=.15, max.overlaps=25,
                  point.padding=0.3, box.padding=0.4) +
  scale_colour_manual(values=STATE_COLORS, guide="none") +
  scale_fill_manual(values=STATE_COLORS, name="State") +
  theme_classic() +
  labs(x="UMAP-1",y="UMAP-2",title="Custom MST — Milestones on UMAP") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold"))

# ── Panel c: Pseudotime on UMAP ───────────────────────────────────────────
pt_umap_df            <- umap_df
pt_umap_df$pseudotime <- cd4_ref@meta.data$mst_pseudotime_norm

p_mst_pseudo <- ggplot(pt_umap_df[sample(nrow(pt_umap_df)),],
                        aes(x=UMAP_1,y=UMAP_2,colour=pseudotime)) +
  geom_point(size=.35, alpha=.7) +
  scale_colour_gradientn(
    colours = c("#0D0887","#6A00A8","#B12A90","#E16462","#FCA636","#F0F921"),
    name    = "Pseudotime\n(0–100)", limits=c(0,100)) +
  geom_segment(data=mst_edge_df,
               aes(x=x1,y=y1,xend=x2,yend=y2),
               colour="black", linewidth=.7, alpha=.6, inherit.aes=FALSE) +
  theme_classic() +
  labs(x="UMAP-1",y="UMAP-2",title="Custom MST — Pseudotime on UMAP") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold"))

print((p_mst_linear) / (p_mst_umap_ms | p_mst_pseudo))

# Panel A: Linear trajectory
print(p_mst_linear)

# Panel B: Milestones on UMAP  
print(p_mst_umap_ms)

# Panel C: Pseudotime on UMAP
print(p_mst_pseudo)

5.4 Visualisation

# Panel B: Milestones on UMAP  
print(p_mst_umap_ms)

# Panel C: Pseudotime on UMAP
print(p_mst_pseudo)

---

6 Method 2 — Monocle3 Trajectory

Monocle3 fits a principal graph directly to the data topology using reversed graph embedding, then assigns pseudotime by geodesic distance from the root.

6.1 Convert & Preprocess

DefaultAssay(cd4_ref) <- "RNA"

cd4_ref_joined <- JoinLayers(cd4_ref)
cds <- as.cell_data_set(cd4_ref_joined)

colData(cds)[[STATE_COL]] <- cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]]
colData(cds)$milestone    <- cd4_ref@meta.data$milestone

reducedDims(cds)[["PCA"]]  <- Embeddings(cd4_ref, "pca")
reducedDims(cds)[["UMAP"]] <- Embeddings(cd4_ref, UMAP_NAME)

cds <- estimate_size_factors(cds)
cds@clusters$UMAP$clusters <- cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]]

cat("cell_data_set created:\n")

cell_data_set created:

cat(sprintf("  %d cells | %d genes\n", ncol(cds), nrow(cds)))

  11466 cells | 36601 genes

6.2 Learn Graph & Set Root

set.seed(42)
DefaultAssay(cd4_ref) <- "RNA"
cd4_ref_joined <- JoinLayers(cd4_ref)
cds <- as.cell_data_set(cd4_ref_joined)

# ── Transfer metadata ──────────────────────────────────────────────────────
colData(cds)[[STATE_COL]] <- cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]]
colData(cds)$milestone    <- cd4_ref@meta.data$milestone

# ── Transfer reductions ───────────────────────────────────────────────────
reducedDims(cds)[["PCA"]]  <- Embeddings(cd4_ref, "pca")
reducedDims(cds)[["UMAP"]] <- Embeddings(cd4_ref, UMAP_NAME)

cds <- estimate_size_factors(cds)

# ── FIX: Set BOTH clusters AND partitions with NAMED factors ──────────────
# learn_graph() checks: names(cds@clusters$UMAP$partitions) != NULL
cell_ids <- colnames(cds)

# Clusters: named factor of state labels
cluster_vec <- setNames(
  factor(cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]]),
  cell_ids
)

# Partitions: all cells in one partition (required slot, use_partition=FALSE
# ignores boundaries but the slot must still be a named factor)
partition_vec <- setNames(
  factor(rep(1L, length(cell_ids))),
  cell_ids
)

cds@clusters$UMAP$clusters   <- cluster_vec
cds@clusters$UMAP$partitions  <- partition_vec

# Verify names are present before calling learn_graph
stopifnot(
  "clusters must be named"   = !is.null(names(cds@clusters$UMAP$clusters)),
  "partitions must be named" = !is.null(names(cds@clusters$UMAP$partitions)),
  "cluster length matches"   = length(cds@clusters$UMAP$clusters) == ncol(cds),
  "partition length matches" = length(cds@clusters$UMAP$partitions) == ncol(cds)
)
cat(sprintf("✅ clusters and partitions set: %d cells\n", ncol(cds)))

✅ clusters and partitions set: 11466 cells

cat("cell_data_set created:\n")

cell_data_set created:

cat(sprintf("  %d cells | %d genes\n", ncol(cds), nrow(cds)))

  11466 cells | 36601 genes

# ── learn_graph ────────────────────────────────────────────────────────────
set.seed(42)
cds <- learn_graph(
  cds,
  use_partition       = FALSE,
  close_loop          = FALSE,
  learn_graph_control = list(minimal_branch_len = 8, nn.k = 20),
  verbose             = FALSE
)
cat("✅ learn_graph complete\n")

✅ learn_graph complete

6.3 Order Cells & Assign Pseudotime

# Set root at CD4 Naive centroid and assign pseudotime
tn_cells    <- colnames(cds)[colData(cds)[[STATE_COL]] == "CD4 Naive"]
tn_umap     <- reducedDims(cds)[["UMAP"]][tn_cells, , drop = FALSE]
tn_centroid <- colMeans(tn_umap)

pr_nodes     <- t(cds@principal_graph_aux[["UMAP"]]$dp_mst)
node_dists   <- rowSums((pr_nodes - matrix(tn_centroid, nrow=nrow(pr_nodes),
                                            ncol=2, byrow=TRUE))^2)
root_pr_node <- names(which.min(node_dists))
cat(sprintf("Root principal graph node: %s\n", root_pr_node))

Root principal graph node: Y_14

cds <- order_cells(cds, root_pr_nodes = root_pr_node)

pt_raw <- pseudotime(cds)
cat(sprintf("Pseudotime: %d non-NA | %d NA\n",
            sum(!is.na(pt_raw)), sum(is.na(pt_raw))))

Pseudotime: 11466 non-NA | 0 NA

cat(sprintf("Raw range: %.3f – %.3f\n",
            min(pt_raw, na.rm=TRUE), max(pt_raw, na.rm=TRUE)))

Raw range: 0.000 – 25.356

stopifnot("order_cells produced all NA — check root node" = sum(!is.na(pt_raw)) > 0)

# Normalise and write to cd4_ref metadata
pt_min <- min(pt_raw, na.rm=TRUE)
pt_max <- max(pt_raw, na.rm=TRUE)

meta <- cd4_ref@meta.data
meta$monocle3_pseudotime      <- as.numeric(pt_raw)
meta$monocle3_pseudotime_norm <- 100 * (as.numeric(pt_raw) - pt_min) /
                                        (pt_max - pt_min)
cd4_ref@meta.data <- meta

cat(sprintf("Non-NA in metadata: %d / %d\n",
            sum(!is.na(cd4_ref@meta.data$monocle3_pseudotime_norm)),
            ncol(cd4_ref)))

Non-NA in metadata: 11466 / 11466

cat("\nMedian pseudotime per state (Naive < TCM < TEM < Temra expected):\n")

Median pseudotime per state (Naive < TCM < TEM < Temra expected):

cd4_ref@meta.data %>%
  group_by(!!sym(STATE_COL)) %>%
  summarise(median_pt = round(median(monocle3_pseudotime_norm, na.rm=TRUE), 1),
            .groups   = "drop") %>%
  arrange(median_pt) %>%
  print()

6.4 Visualisation

pr_graph_obj <- principal_graph(cds)[["UMAP"]]
pr_layout    <- t(cds@principal_graph_aux[["UMAP"]]$dp_mst)

m3_edge_list <- igraph::as_edgelist(pr_graph_obj)
m3_edge_df   <- do.call(rbind, lapply(seq_len(nrow(m3_edge_list)), function(i) {
  n1 <- m3_edge_list[i,1]; n2 <- m3_edge_list[i,2]
  data.frame(x1=pr_layout[n1,1], y1=pr_layout[n1,2],
             x2=pr_layout[n2,1], y2=pr_layout[n2,2])
}))

umap_m3            <- umap_df
umap_m3$pseudotime <- cd4_ref@meta.data$monocle3_pseudotime_norm

p_m3_states <- ggplot() +
  geom_point(data=umap_m3[sample(nrow(umap_m3)),],
             aes(x=UMAP_1, y=UMAP_2, colour=state), size=.35, alpha=.6) +
  geom_segment(data=m3_edge_df,
               aes(x=x1,y=y1,xend=x2,yend=y2),
               colour="black", linewidth=.6, alpha=.7, lineend="round") +
  scale_colour_manual(values=STATE_COLORS, name="State") +
  theme_classic() +
  labs(x="UMAP-1",y="UMAP-2", title="Monocle3 — Principal Graph & States") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold"))

p_m3_pseudo <- ggplot(umap_m3[sample(nrow(umap_m3)),],
                       aes(x=UMAP_1, y=UMAP_2, colour=pseudotime)) +
  geom_point(size=.35, alpha=.7) +
  scale_colour_gradientn(
    colours=c("#0D0887","#6A00A8","#B12A90","#E16462","#FCA636","#F0F921"),
    name="Pseudotime\n(0–100)", limits=c(0,100)) +
  geom_segment(data=m3_edge_df,
               aes(x=x1,y=y1,xend=x2,yend=y2),
               colour="black", linewidth=.6, alpha=.6, inherit.aes=FALSE) +
  theme_classic() +
  labs(x="UMAP-1",y="UMAP-2", title="Monocle3 — Pseudotime on UMAP") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold"))

m3_pt_df <- data.frame(
  state      = factor(cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]], levels=STATE_ORDER),
  pseudotime = cd4_ref@meta.data$monocle3_pseudotime_norm
) %>% filter(!is.na(pseudotime), state %in% STATE_ORDER)

p_m3_violin <- ggplot(m3_pt_df, aes(x=state, y=pseudotime, fill=state)) +
  geom_violin(scale="width", trim=FALSE, alpha=.85) +
  geom_boxplot(width=.08, fill="white", outlier.size=.3, outlier.alpha=.3) +
  scale_fill_manual(values=STATE_COLORS, guide="none") +
  theme_classic() +
  labs(x=NULL, y="Pseudotime (0–100)", title="Monocle3 — Pseudotime per State") +
  theme(axis.text.x=element_text(size=11, face="bold"),
        plot.title=element_text(size=13,face="bold"))

print((p_m3_states | p_m3_pseudo) / (p_m3_violin | plot_spacer()))

p_m3_states
p_m3_pseudo
p_m3_violin 

6.5 Trajectory-Variable Genes

var_genes_use <- head(VariableFeatures(cd4_ref), 2000)
var_genes_use <- intersect(var_genes_use, rownames(cds))
cat(sprintf("Variable genes for graph_test: %d\n", length(var_genes_use)))

Variable genes for graph_test: 2000

cat("Running graph_test (Moran's I)...\n")

Running graph_test (Moran's I)...

pr_test_res <- graph_test(
  cds[var_genes_use, ],
  neighbor_graph = "principal_graph",
  cores          = 2
)

  |                                                                                                                        |   0%, ETA NA
  |                                                                                                                     |   0%, ETA 04:16
  |                                                                                                                     |   0%, ETA 02:38
  |                                                                                                                     |   0%, ETA 01:47
  |                                                                                                                     |   0%, ETA 01:35
  |                                                                                                                     |   0%, ETA 01:17
  |                                                                                                                     |   0%, ETA 01:14
  |                                                                                                                     |   0%, ETA 01:04
  |                                                                                                                     |   0%, ETA 01:03
  |=                                                                                                                    |   0%, ETA 00:57
  |=                                                                                                                    |   0%, ETA 00:58
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:53
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:53
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:50
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:50
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:49
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:48
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:47
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:46
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:45
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:43
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:44
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:42
  |=                                                                                                                    |   1%, ETA 00:41
  |==                                                                                                                   |   1%, ETA 00:42
  |==                                                                                                                   |   1%, ETA 00:41
  |==                                                                                                                   |   1%, ETA 00:41
  |==                                                                                                                   |   1%, ETA 00:41
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:41
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:41
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:40
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:41
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:40
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:40
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:39
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:39
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:39
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:39
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:38
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:38
  |==                                                                                                                   |   2%, ETA 00:38
  |===                                                                                                                  |   2%, ETA 00:38
  |===                                                                                                                  |   2%, ETA 00:38
  |===                                                                                                                  |   2%, ETA 00:38
  |===                                                                                                                  |   2%, ETA 00:38
  |===                                                                                                                  |   2%, ETA 00:37
  |===                                                                                                                  |   2%, ETA 00:37
  |===                                                                                                                  |   2%, ETA 00:37
  |===                                                                                                                  |   2%, ETA 00:37
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:37
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:37
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:36
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:37
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:36
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:36
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:36
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:37
  |===                                                                                                                  |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:35
  |====                                                                                                                 |   3%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   4%, ETA 00:36
  |====                                                                                                                 |   4%, ETA 00:36
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  |====                                                                                                                 |   4%, ETA 00:35
  |====                                                                                                                 |   4%, ETA 00:35
  |====                                                                                                                 |   4%, ETA 00:35
  |====                                                                                                                 |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
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  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   4%, ETA 00:34
  |=====                                                                                                                |   5%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   5%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   5%, ETA 00:35
  |=====                                                                                                                |   5%, ETA 00:34
  |======                                                                                                               |   5%, ETA 00:35
  |======                                                                                                               |   5%, ETA 00:35
  |======                                                                                                               |   5%, ETA 00:34
  |======                                                                                                               |   5%, ETA 00:34
  |======                                                                                                               |   5%, ETA 00:34
  |======                                                                                                               |   5%, ETA 00:34
  |======                                                                                                               |   5%, ETA 00:34
  |======                                                                                                               |   5%, ETA 00:34
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  |======                                                                                                               |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:34
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:33
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:33
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:33
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:33
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:33
  |=======                                                                                                              |   6%, ETA 00:33
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  |========                                                                                                             |   6%, ETA 00:33
  |========                                                                                                             |   7%, ETA 00:33
  |========                                                                                                             |   7%, ETA 00:33
  |========                                                                                                             |   7%, ETA 00:33
  |========                                                                                                             |   7%, ETA 00:33
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  |========                                                                                                             |   7%, ETA 00:33
  |========                                                                                                             |   7%, ETA 00:33
  |========                                                                                                             |   7%, ETA 00:33
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  |========                                                                                                             |   7%, ETA 00:33
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  |=========                                                                                                            |   7%, ETA 00:33
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:33
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:33
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:33
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:33
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:32
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:33
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:32
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:32
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:32
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:32
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:32
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:32
  |=========                                                                                                            |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   8%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |==========                                                                                                           |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |   9%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |  10%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |  10%, ETA 00:32
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  |===========                                                                                                          |  10%, ETA 00:32
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  |===========                                                                                                          |  10%, ETA 00:32
  |===========                                                                                                          |  10%, ETA 00:32
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:32
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  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:32
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  10%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  11%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  11%, ETA 00:31
  |============                                                                                                         |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  11%, ETA 00:31
  |=============                                                                                                        |  12%, ETA 00:31
  |==============                                                                                                       |  12%, ETA 00:31
  |==============                                                                                                       |  12%, ETA 00:31
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  |==============                                                                                                       |  12%, ETA 00:31
  |==============                                                                                                       |  12%, ETA 00:31
  |==============                                                                                                       |  12%, ETA 00:30
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  |==============                                                                                                       |  12%, ETA 00:30
  |==============                                                                                                       |  12%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  12%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  12%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  12%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
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  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
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  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
  |===============                                                                                                      |  13%, ETA 00:30
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  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:30
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:30
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:30
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:30
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:30
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:30
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:30
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:29
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:30
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:29
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:29
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:29
  |================                                                                                                     |  14%, ETA 00:29
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  |========================                                                                                             |  21%, ETA 00:27
  |========================                                                                                             |  21%, ETA 00:27
  |========================                                                                                             |  21%, ETA 00:27
  |========================                                                                                             |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  21%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  22%, ETA 00:27
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  |=========================                                                                                            |  22%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  22%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  22%, ETA 00:27
  |=========================                                                                                            |  22%, ETA 00:27
  |==========================                                                                                           |  22%, ETA 00:27
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  |==========================                                                                                           |  22%, ETA 00:27
  |==========================                                                                                           |  22%, ETA 00:27
  |==========================                                                                                           |  22%, ETA 00:26
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  |=============================                                                                                        |  24%, ETA 00:26
  |=============================                                                                                        |  24%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |=============================                                                                                        |  25%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  25%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  25%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  25%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  25%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  25%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
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  |==============================                                                                                       |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  26%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  27%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  27%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  27%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  27%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  27%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  27%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  27%, ETA 00:25
  |===============================                                                                                      |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:25
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:24
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:24
  |================================                                                                                     |  27%, ETA 00:24
  |================================                                                                                     |  28%, ETA 00:24
  |================================                                                                                     |  28%, ETA 00:24
  |================================                                                                                     |  28%, ETA 00:24
  |================================                                                                                     |  28%, ETA 00:24
  |================================                                                                                     |  28%, ETA 00:24
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  |======================================                                                                               |  32%, ETA 00:23
  |======================================                                                                               |  32%, ETA 00:23
  |======================================                                                                               |  32%, ETA 00:23
  |======================================                                                                               |  32%, ETA 00:23
  |======================================                                                                               |  32%, ETA 00:23
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  |======================================                                                                               |  33%, ETA 00:23
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  |=========================================                                                                            |  35%, ETA 00:22
  |=========================================                                                                            |  35%, ETA 00:22
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  |=========================================                                                                            |  35%, ETA 00:22
  |==========================================                                                                           |  36%, ETA 00:22
  |==========================================                                                                           |  36%, ETA 00:22
  |==========================================                                                                           |  36%, ETA 00:21
  |==========================================                                                                           |  36%, ETA 00:21
  |==========================================                                                                           |  36%, ETA 00:21
  |==========================================                                                                           |  36%, ETA 00:21
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  |=======================================================                                                              |  47%, ETA 00:18
  |=======================================================                                                              |  47%, ETA 00:17
  |=======================================================                                                              |  47%, ETA 00:17
  |=======================================================                                                              |  47%, ETA 00:17
  |========================================================                                                             |  47%, ETA 00:17
  |========================================================                                                             |  48%, ETA 00:17
  |========================================================                                                             |  48%, ETA 00:17
  |========================================================                                                             |  48%, ETA 00:17
  |========================================================                                                             |  48%, ETA 00:17
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  |=========================================================                                                            |  48%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
  |=========================================================                                                            |  49%, ETA 00:17
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  |==========================================================                                                           |  49%, ETA 00:17
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  |==========================================================                                                           |  49%, ETA 00:17
  |==========================================================                                                           |  49%, ETA 00:17
  |==========================================================                                                           |  50%, ETA 00:17
  |==========================================================                                                           |  50%, ETA 00:17
  |==========================================================                                                           |  50%, ETA 00:17
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  |==========================================================                                                           |  50%, ETA 00:17
  |==========================================================                                                           |  50%, ETA 00:17
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  |===========================================================                                                          |  50%, ETA 00:17
  |===========================================================                                                          |  50%, ETA 00:17
  |===========================================================                                                          |  50%, ETA 00:17
  |===========================================================                                                          |  50%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  50%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  50%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  51%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  51%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  51%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  51%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  51%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  51%, ETA 00:16
  |===========================================================                                                          |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  51%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  52%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  52%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  52%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  52%, ETA 00:16
  |============================================================                                                         |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  52%, ETA 00:16
  |=============================================================                                                        |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:16
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:15
  |==============================================================                                                       |  53%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  53%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |===============================================================                                                      |  54%, ETA 00:15
  |================================================================                                                     |  54%, ETA 00:15
  |================================================================                                                     |  54%, ETA 00:15
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  |================================================================                                                     |  55%, ETA 00:15
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  |=========================================================================                                            |  62%, ETA 00:13
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# Add gene name as column and filter significant hits
sig_traj_genes <- pr_test_res %>%
  tibble::rownames_to_column("gene") %>%
  filter(q_value < 0.05, status == "OK") %>%
  arrange(desc(morans_I))

cat(sprintf("%d trajectory-variable genes (q < 0.05)\n", nrow(sig_traj_genes)))

1851 trajectory-variable genes (q < 0.05)

# Define genes to exclude from dotplot — ribosomal, mitochondrial, housekeeping
# These are trajectory-variable due to technical reasons not biology
exclude_genes <- grep(
  "^RP[SL]|^MT-|^MALAT1|^NEAT1|^XIST|^ACTB|^GAPDH|^B2M|^EEF|^EIF",
  rownames(cd4_ref), value = TRUE
)
cat(sprintf("Genes to exclude (technical): %d\n", length(exclude_genes)))

Genes to exclude (technical): 199

kable(head(sig_traj_genes[, c("gene","morans_I","q_value")], 20),
      caption = "Top 20 trajectory-variable genes (Monocle3 graph_test)",
      digits  = 4) %>%
  kable_styling(bootstrap_options=c("striped","condensed"), full_width=FALSE)

Top 20 trajectory-variable genes (Monocle3 graph_test)

gene	morans_I	q_value
CCL5	0.6551	0
RPL32	0.5215	0
EEF1A1	0.5053	0
RPS14	0.5000	0
RPL10	0.4992	0
RPL30	0.4969	0
RPL41	0.4953	0
RPS3A	0.4940	0
RPL34	0.4790	0
RPS13	0.4789	0
RPL39	0.4763	0
RPL19	0.4637	0
RPS8	0.4579	0
RPS23	0.4571	0
RPS12	0.4545	0
RPS27A	0.4537	0
FOXP3	0.4198	0
RPLP1	0.4049	0
LGALS3	0.4027	0
RPS18	0.4008	0

# ── Ensure milestone_factor exists ────────────────────────────────────────
if (!"milestone_factor" %in% colnames(cd4_ref@meta.data)) {
  cd4_ref@meta.data$milestone_factor <- factor(
    cd4_ref@meta.data$milestone, levels = milestone_order
  )
}

# ── Filter technical genes and take top n ─────────────────────────────────
n_keep <- 100

clean_traj_genes <- sig_traj_genes %>%
  filter(!gene %in% exclude_genes) %>%        # use gene column not rownames
  slice_head(n = n_keep) %>%
  pull(gene)                                   # extract as character vector

cat(sprintf("Clean trajectory genes: %d (removed %d technical)\n",
            length(clean_traj_genes),
            nrow(sig_traj_genes) - length(clean_traj_genes)))

Clean trajectory genes: 100 (removed 1751 technical)

cat("First 10:", paste(head(clean_traj_genes, 10), collapse=", "), "\n")

First 10: CCL5, FOXP3, LGALS3, GZMK, ANXA2, S100A4, TPT1, ITGB1, AHNAK, TMSB4X 

# ── Confirm genes exist in object ─────────────────────────────────────────
clean_traj_genes <- intersect(clean_traj_genes, rownames(cd4_ref))
cat(sprintf("Genes found in cd4_ref: %d\n", length(clean_traj_genes)))

Genes found in cd4_ref: 100

# ── DotPlot ───────────────────────────────────────────────────────────────
DefaultAssay(cd4_ref) <- "RNA"
Idents(cd4_ref)       <- "milestone_factor"

p_dot <- DotPlot(
  cd4_ref,
  features  = clean_traj_genes,
  cols      = c("lightgrey", "#d62728"),
  dot.scale = 6,
  scale     = TRUE
) +
  RotatedAxis() +
  coord_flip() +
  ggtitle(sprintf("Top %d Monocle3 Trajectory Genes — Milestones M00–M07", n_keep)) +
  theme(axis.text.x = element_text(size = 8, face = "bold"),
        axis.text.y = element_text(size = 7),
        plot.title  = element_text(size = 13, face = "bold"))

print(p_dot)

---

7 Method Comparison

Key question: Do the two methods agree on cell ordering?

7.1 Pseudotime Correlation

compare_df <- data.frame(
  cell        = colnames(cd4_ref),
  state       = factor(cd4_ref@meta.data[[STATE_COL]], levels=STATE_ORDER),
  mst_pt      = cd4_ref@meta.data$mst_pseudotime_norm,
  monocle3_pt = cd4_ref@meta.data$monocle3_pseudotime_norm,
  milestone   = cd4_ref@meta.data$milestone
) %>% filter(!is.na(mst_pt), !is.na(monocle3_pt), state %in% STATE_ORDER)

overall_cor <- cor(compare_df$mst_pt, compare_df$monocle3_pt,
                   method = "spearman", use = "complete.obs")

per_state_cor <- compare_df %>%
  group_by(state) %>%
  summarise(
    n         = n(),
    spearman  = round(cor(mst_pt, monocle3_pt, method="spearman"), 3),
    mean_diff = round(mean(mst_pt - monocle3_pt), 1),
    sd_diff   = round(sd(mst_pt - monocle3_pt), 1),
    .groups   = "drop"
  )

p_scatter <- ggplot(
  compare_df[sample(nrow(compare_df), min(5000,nrow(compare_df))),],
  aes(x=mst_pt, y=monocle3_pt, colour=state)
) +
  geom_point(size=.6, alpha=.5) +
  geom_abline(slope=1, intercept=0, linetype="dashed", colour="grey40", linewidth=.8) +
  geom_smooth(method="lm", se=FALSE, colour="black", linewidth=.8) +
  scale_colour_manual(values=STATE_COLORS, name="State") +
  annotate("text", x=5, y=92,
           label=sprintf("Spearman ρ = %.3f", overall_cor),
           size=4.5, fontface="bold", hjust=0) +
  theme_classic() +
  labs(x="Custom MST pseudotime (0–100)", y="Monocle3 pseudotime (0–100)",
       title="Pseudotime correlation: Custom MST vs Monocle3",
       subtitle="Dashed line = perfect agreement | Solid line = linear fit") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold"))

p_density <- ggplot(
  compare_df %>%
    pivot_longer(c(mst_pt, monocle3_pt), names_to="method", values_to="pseudotime") %>%
    mutate(method = recode(method, mst_pt="Custom MST", monocle3_pt="Monocle3")),
  aes(x=pseudotime, colour=method, fill=method)
) +
  geom_density(alpha=.35) +
  scale_colour_manual(values=METHOD_COLORS, name="Method") +
  scale_fill_manual(values=METHOD_COLORS, name="Method") +
  facet_wrap(~state, ncol=3, scales="free_y") +
  theme_classic() +
  labs(x="Pseudotime (0–100)", y="Density",
       title="Pseudotime distribution per state: method comparison") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold"),
        strip.text=element_text(face="bold"))

print(p_scatter | p_density)

cat(sprintf("\nOverall Spearman ρ = %.3f\n\n", overall_cor))

Overall Spearman ρ = 0.733

kable(per_state_cor,
      caption = "Per-state pseudotime correlation (Spearman)",
      col.names = c("State","N cells","Spearman ρ","Mean diff","SD diff")) %>%
  kable_styling(bootstrap_options=c("striped","hover"), full_width=FALSE)

Per-state pseudotime correlation (Spearman)

State	N cells	Spearman ρ	Mean diff	SD diff
CD4 Naive	2037	0.179	-5.3	13.3
CD4 TCM	9067	0.663	0.0	24.5
CD4 TEM	145	0.395	-7.7	12.5
CD4 Temra/CTL	10	-0.190	0.1	1.8
Treg	207	0.912	39.5	22.9

7.2 Side-by-Side UMAP

umap_compare             <- umap_df
umap_compare$mst_pt      <- cd4_ref@meta.data$mst_pseudotime_norm
umap_compare$monocle3_pt <- cd4_ref@meta.data$monocle3_pseudotime_norm

pt_gradient <- scale_colour_gradientn(
  colours=c("#0D0887","#6A00A8","#B12A90","#E16462","#FCA636","#F0F921"),
  name="Pseudotime\n(0–100)", limits=c(0,100)
)

p_side_mst <- ggplot(umap_compare[sample(nrow(umap_compare)),],
                      aes(x=UMAP_1,y=UMAP_2,colour=mst_pt)) +
  geom_point(size=.35,alpha=.7) +
  geom_segment(data=mst_edge_df, aes(x=x1,y=y1,xend=x2,yend=y2),
               colour="black",linewidth=.7,alpha=.6,inherit.aes=FALSE) +
  pt_gradient + theme_classic() +
  labs(x="UMAP-1",y="UMAP-2",title="Custom MST") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold",colour=METHOD_COLORS["Custom MST"]))

p_side_m3 <- ggplot(umap_compare[sample(nrow(umap_compare)),],
                     aes(x=UMAP_1,y=UMAP_2,colour=monocle3_pt)) +
  geom_point(size=.35,alpha=.7) +
  geom_segment(data=m3_edge_df, aes(x=x1,y=y1,xend=x2,yend=y2),
               colour="black",linewidth=.6,alpha=.6,inherit.aes=FALSE) +
  pt_gradient + theme_classic() +
  labs(x="UMAP-1",y="UMAP-2",title="Monocle3") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold",colour=METHOD_COLORS["Monocle3"]))

print(p_side_mst | p_side_m3)

7.3 Discordant Cells

compare_df$abs_diff <- abs(compare_df$mst_pt - compare_df$monocle3_pt)
threshold <- quantile(compare_df$abs_diff, 0.90, na.rm=TRUE)

discordant <- compare_df %>% filter(abs_diff > threshold) %>% arrange(desc(abs_diff))

cat(sprintf("Top 10%% most discordant cells (|diff| > %.1f): %d cells\n",
            threshold, nrow(discordant)))

Top 10% most discordant cells (|diff| > 40.0): 1147 cells

umap_disc            <- umap_df
umap_disc$discordant <- rownames(umap_disc) %in% discordant$cell
umap_disc$abs_diff   <- compare_df$abs_diff[match(rownames(umap_disc), compare_df$cell)]

p_discordant <- ggplot(umap_disc[sample(nrow(umap_disc)),], aes(x=UMAP_1,y=UMAP_2)) +
  geom_point(data=~filter(., !discordant), colour="grey85", size=.3, alpha=.5) +
  geom_point(data=~filter(., discordant), aes(colour=abs_diff), size=.8, alpha=.85) +
  scale_colour_gradient(low="#FCA636", high="#C00000", name="|MST − M3|") +
  theme_classic() +
  labs(x="UMAP-1",y="UMAP-2",
       title="Discordant cells (top 10% disagreement)",
       subtitle="Boundary/transition cells — biologically expected") +
  theme(plot.title=element_text(size=13,face="bold"))

disc_states <- discordant %>% count(state) %>% mutate(pct=round(100*n/sum(n),1))

p_disc_bar <- ggplot(disc_states, aes(x=reorder(state,-n), y=pct, fill=state)) +
  geom_col(width=.7) +
  geom_text(aes(label=sprintf("%.0f%%",pct)), vjust=-.3, size=3.5) +
  scale_fill_manual(values=STATE_COLORS, guide="none") +
  theme_classic() +
  labs(x="State", y="% of discordant cells", title="State composition of discordant cells") +
  theme(plot.title=element_text(size=12,face="bold"))

print(p_discordant | p_disc_bar)

7.4 Which Method to Use?

if (overall_cor > 0.9) {
  rec <- "HIGH agreement (ρ > 0.9): either method valid. Use **Custom MST** for milestone labels; **Monocle3** for graph_test() trajectory genes."
} else if (overall_cor > 0.7) {
  rec <- "MODERATE agreement (ρ = 0.7–0.9): similar ordering, differ at boundaries. Use both as complementary evidence."
} else {
  rec <- "LOW agreement (ρ < 0.7): significant discordance. Check UMAP topology and milestone assignments."
}

---

8 Marker DotPlot per Milestone

DefaultAssay(cd4_ref) <- "RNA"

cd4_ref@meta.data$milestone_factor <- factor(
  cd4_ref@meta.data$milestone, levels = milestone_order
)
Idents(cd4_ref) <- "milestone_factor"

panel_genes <- c(
  # Naive
  "CCR7","LEF1","TCF7","SELL","KLF2","SATB1","IL7R","CD27","MAL",
  # TCM
  "S100A4","AQP3","LTB","ITGB1","CD44","CCR4",
  # Shared activation
  "CD69","LMNA",
  # TEM — effector memory and Th1 skewing
  "GZMK","CCL5","EOMES","CXCR3","HOPX","CXCR4","IFNG","TNF","CCR5",
  # Temra/CTL — terminal cytotoxic effector
  "GZMB","GZMA","PRF1","NKG7","CX3CR1","FGFBP2","GNLY","TBX21","ZEB2",
  "FCGR3A","KLRG1","NR4A2",
  # Treg — core identity
  "FOXP3","IL2RA","IKZF2","IKZF4","TIGIT","RTKN2","TNFRSF18","CTLA4",
  # Co-inhibitory receptors — shared between effector Treg and exhaustion
  # Expression here reflects Treg suppressive machinery, NOT dysfunction
  # Critical for Sézary interpretation: Treg-like vs exhausted identity
  "PDCD1","HAVCR2","LAG3"
)

panel_genes <- unique(intersect(panel_genes, rownames(cd4_ref)))

p_dotplot_ms <- DotPlot(
  cd4_ref,
  features  = panel_genes,
  group.by  = "milestone_factor",
  cols      = c("lightgrey","#d62728"),
  dot.scale = 4, scale = TRUE, col.min = -1.5, col.max = 2.5
) +
  RotatedAxis() + coord_flip() +
  theme(axis.text.x     = element_text(size=8, face="bold"),
        axis.text.y     = element_text(size=7),
        plot.title      = element_text(size=13,face="bold"),
        legend.position = "bottom") +
  ggtitle("Marker gene expression per milestone")

print(p_dotplot_ms)

---

saveRDS(cd4_ref,             "Objects/cd4_ref_dual_trajectory.rds")
saveRDS(cds,                 "Objects/monocle3_cds.rds")
saveRDS(mst_graph,           "Objects/mst_graph.rds")           # ← ADD
saveRDS(milestone_centroids, "Objects/milestone_centroids.rds") # ← ADD

write.csv(milestone_centroids, "Tables/milestone_centroids.csv",          row.names=FALSE)
write.csv(per_state_cor,       "Tables/method_comparison_per_state.csv",  row.names=FALSE)
write.csv(sig_traj_genes,      "Tables/monocle3_trajectory_genes.csv",    row.names=FALSE)

ggsave("Figures/fig_milestones_linear.pdf",  p_mst_linear,    width=14, height=4)
ggsave("Figures/fig_mst_umap.pdf",           p_mst_umap_ms,   width=10, height=8)
ggsave("Figures/fig_mst_pseudotime.pdf",     p_mst_pseudo,    width=10, height=8)
ggsave("Figures/fig_m3_pseudotime.pdf",      p_m3_pseudo,     width=10, height=8)
ggsave("Figures/fig_method_comparison.pdf",  p_scatter,       width=10, height=6)
ggsave("Figures/fig_dotplot_milestones.pdf", p_dotplot_ms,    width=9,  height=18)

cat("✅ All reference outputs saved\n")

✅ All reference outputs saved