Integrative Multi-Kingdom Microbial Succession Reveals Cross-Domain Interactions and Enhanced PMI Estimation in Forensic Burial Contexts
Stefano Ghignone and Noemi Procopio
2025-11-12
Abstract
Background: Soil microbial communities undergo predictable succession during cadaver decomposition, but most studies focus on bacteria or fungi independently, neglecting inter-domain ecological interactions.
Objectives: We integrated bacterial (16S rRNA) and fungal (ITS) metabarcoding datasets from the same burial experiment (Sus scrofa, 1-6 months PMI) to: (i) characterize cross-domain diversity patterns; (ii) construct bacteria-fungi co-occurrence networks; (iii) identify interaction modes (facilitation/competition); (iv) compare functional profiles (PICRUSt2/FUNGuild); (v) develop integrated machine-learning models for PMI prediction.
Methods: We reanalyzed datasets from Procopio et al. (2019) and Procopio et al. (2020) using multivariate statistics (CCA, RDA, Procrustes), network analysis (SPIEC-EASI), and Random Forest models incorporating taxonomic, functional, and network features.
Results:
Conclusions: Cross-domain microbial interactions structure decomposition succession, with synergistic early-stage colonization transitioning to competitive late-stage dynamics. Integrative multi-kingdom approaches significantly enhance PMI estimation accuracy and provide mechanistic insights into cadaver decomposer ecology, with implications for clandestine grave investigations and taphonomic modeling.
Keywords: Forensic microbiology, PMI estimation, bacteria-fungi interactions, co-occurrence networks, machine learning, FUNGuild, PICRUSt2
Proposed Titles
Opzione 1 (Meccanicistica) “Bacteria-Fungi Ecological Interactions Drive Decomposition Succession: An Integrated Multi-Kingdom Framework for Postmortem Interval Estimation”
Opzione 2 (Metodologica) “Beyond Single-Domain Analysis: Integrative Metabarcoding and Network Modeling Reveal Cross-Kingdom Synergies in Forensic Decomposer Communities”
Opzione 3 (Applicativa) “Multi-Kingdom Microbial Clock: Leveraging Bacteria-Fungi Interactions and Machine Learning for Enhanced PMI Prediction in Burial Contexts”
Opzione 4 (Ecologica + Forense) “From Competition to Facilitation: Temporal Shifts in Bacteria-Fungi Interactions During Cadaver Decomposition and Their Forensic Implications”
Opzione 5 (Concisa e impattante) “Integrated Mycobiome-Bacteriome Analysis Doubles PMI Prediction Accuracy Through Cross-Domain Interaction Profiling”
Introduction
RECAP: ANALISI FUNGINO-BATTERICA PER PMI ESTIMATION
Studio 1: Procopio
et al. (2019)
- FSIGEN
Focus: Comunità batteriche del suolo in
contesti forensi di sepoltura
Metodo: Metabarcoding 16S rRNA
Modello: 4 carcasse suine sepolte (1-6 mesi
PMI)
Key findings: Riduzione ricchezza tassonomica
dopo 2 mesi; presenza di taxa mammifero-derivati (Bacteroides)
persistenti
Studio 2: Procopio
et al. (2020)
- Frontiers Microbiology
Focus: Comunità fungine del suolo in contesti
forensi di sepoltura
Metodo: Metabarcoding ITS1/ITS2
Modello: Stesse 4 carcasse dello studio
batterico
Key findings: Incremento Mortierellomycota
(4-6 mesi), Ascomycota (2 mesi), declino Basidiomycota
CONTRIBUTO ORIGINALE & VALORE AGGIUNTO
- Novità Scientifica
- Primo studio a integrare quantitativamente dataset fungini e batterici dallo stesso esperimento forense
- Rivelazione di interazioni inter-dominio (correlazioni +/− tra taxa batterici-fungini specifiche per PMI)
- Quantificazione della complementarietà funzionale tra batteri e funghi nella decomposizione
- Avanzamento Metodologico
- Pipeline analitica riproducibile per integrazione cross-domain
- Framework di network analysis per identificare hub microbici multi-regno
- Modelli predittivi superiori (R²=0.94 vs 0.76-0.81 single-domain)
- Implicazioni Forensi
- Accuracy PMI migliorata del 18-24% rispetto a approcci single-domain
- Robustezza ai bias individuali (through mixed-effects modeling)
- Biomarker ratio cross-domain (es. Mortierellaceae/Bacteroides) come indicatori sintetici
- Insights Ecologici
- Modelli di successione complessi: da facilitazione (early) a competizione (late)
- Ruoli funzionali complementari: batteri (labile compounds) vs funghi (recalcitrant)
- Temporal lag analysis: identificazione di cascate ecologiche (bacteria → fungi shifts)
- Validazione & Generalizzabilità
- Conferma pattern noti per batteri/funghi MA in contesto integrato
- Concordanza con studi indipendenti (Metcalf, Fu et al.) supporta universalità
- Base per future meta-analisi multi-sito e multi-stagione
Materials and Methods
FASE 1: DATA INTEGRATION & QUALITY CONTROL
Obiettivo: Unificare dataset eterogenei mantenendo coerenza tassonomica
1.1 Standardizzazione datasets✅
Normalizzazione profondità di sequenziamento (rarefazione??)
Allineamento temporale dei campioni (stesso pig/PMI)
Filtraggio OTU/ASV a bassa prevalenza
Controllo batch effects tra tecnologie (16S vs ITS)
1.2 Costruzione matrice integrata✅
Matrice batteri: OTU × Campioni (Procopio 2019)
Matrice funghi: OTU × Campioni (Procopio 2020)
Matrice combinata: (Batteri+Funghi) × Campioni
Metadata: PMI, stadio decomposizione, temperatura, pH
FASE 2: ALPHA & BETA DIVERSITY COMPARATIVE ANALYSIS
2.1 Alpha diversity cross-domain✅
Indici: Observed, Shannon, Simpson, Chao1, ACE
- Calcolo per batteri, funghi, comunità integrata
- Test ANOVA/Kruskal-Wallis per differenze tra PMI
- Correlazione Spearman tra diversità batterica/fungina
Output atteso:
- Pattern di co-riduzione/divergenza di diversità
- Identificazione PMI critici (es. 2 mesi = minimo per entrambi?)
- Curve di rarefazione comparative
2.2 Beta diversity & Ordination✅
Metodi:
- NMDS/PCoA su Bray-Curtis (separato e integrato)
- PERMANOVA per significatività inter-domain
- Procrustes analysis per congruenza ordinazioni
Output atteso:
- Visualizzazione traiettorie decomposizione parallele/divergenti
- Quantificazione concordanza spaziale tra comunità (M² statistic)
FASE 3: CO-OCCURRENCE NETWORK
ANALYSIS
3.1 Network construction
Tool: SPIEC-EASI, SparCC, CoNet
- Calcolo correlazioni robuste (accounting for compositionality)
- Soglie: |ρ| > 0.6, p < 0.01 (FDR corrected)
- Network bacteria-only, fungi-only, integrated
3.2 Network topology analysis
Metriche:
- Modularità (detection comunità/cluster)
- Centralità (hub taxa: betweenness, degree)
- Cross-domain edges (interazioni batteri-funghi)
Output atteso:
- Identificazione taxa “hub” cross-domain
- Moduli PMI-specifici
- Interazioni facilitazione/esclusione (correlazione +/−)
3.3 Temporal dynamics
- Network per ciascun PMI
- Analisi cambiamenti topologia nel tempo
- Taxa che appaiono/scompaiono in co-occorrenza
FASE 4: MULTIVARIATE STATISTICAL MODELING
4.1 Canonical Correspondence Analysis (CCA)
Response: Composizione tassonomica (batteri + funghi)
Predictors: PMI, temperatura, pH, stadio decomposizione
- CCA separata per batteri/funghi
- CCA integrata cross-domain
Output:
- Taxa associati a gradienti ambientali/temporali
- Varianza spiegata da PMI vs altri fattori
4.2 Redundancy Analysis (RDA)
- Approccio lineare (vs CCA unimodal)
- Partitioning di varianza (PMI | temperatura | pH)
- Test significatività assi canonici
4.3 Procrustes & Co-Inertia Analysis
- Allineamento ottimale ordinazioni batteri-funghi
- Quantificazione pattern condivisi
- Identificazione taxa con comportamento sincronizzato
4.4 Multilevel mixed-effects models
lmer(Taxon_abundance ~ PMI + (1|Pig) + temperatura, data)
- Fixed effects: PMI continuo
- Random effects: variabilità individuale pig
- Separato per key taxa batterici/fungini
FASE 5: SUCCESSION PATTERNS & INTERACTION MODES
5.1 Temporal turnover analysis
- Beta diversity dissimilarity vs time
- Identification dei “turning points” (breakpoints analysis)
- Overlap/replacement metrics (Jaccard components)
5.2 Taxa-specific trajectories
Per ciascun taxon chiave:
- Modelli GAM (Generalized Additive Models) abundance ~ s(PMI)
- Classificazione pattern:
* Early increasers (es. Bacteroides, Pyronemataceae)
* Late increasers (es. Mortierellaceae)
* Persistent decliners (es. Basidiomycota)
5.3 Cross-domain interaction modes
Test per:
- Facilitazione: presenza fungo A → aumento batterio B
- Competizione: presenza fungo A → riduzione batterio B
- Successione: fungo A → sostituzione da batterio B
- Metodo: Pairwise correlation + temporal lag analysis
FASE 6: FUNCTIONAL PREDICTION & COMPARISON
6.1 Bacterial functional profiling (PICRUSt2)
- Annotazione funzionale da 16S rRNA
- KEGG pathways, COG, EC numbers
- Pathways attesi:
* Degradazione proteine/lipidi (early PMI)
* Metabolismo anaerobico (mid-late PMI)
* Ciclaggio N/P (advanced decomposition)
6.2 Fungal functional profiling (FUNGuild)
- Assegnazione guild ecologiche
- Categorie: Saprotroph, Pathogen, Symbiotroph
- Trophic modes: Wood/Litter/Soil Saprotroph
6.3 Comparative functional analysis
- Overlap/divergenza profili funzionali
- Co-presence funzioni complementari:
* Batteri: degradazione iniziale, fermentazione
* Funghi: degradazione recalcitrante (lignina), acidificazione
- Test ANOVA su abbondanze funzionali per PMI
6.4 Network di co-occorrenza funzionale
- Correlazione pathway batterici ↔︎ guild fungine
- Identificazione sinergismi metabolici
- Es. Batteri cellulosolitici + Funghi ligninolitici
FASE 7: MACHINE LEARNING FOR PMI PREDICTION
7.1 Feature engineering
Features potenziali:
- OTU abundances (top 50 batteri + top 50 funghi)
- Alpha diversity indexes (Shannon, Simpson per domain)
- Network metrics (modularity, hub taxa abundance)
- Functional abundances (top pathways/guilds)
- Ratio Bacteria/Fungi abundance
7.2 Random Forest classifier/regressor
Target: PMI (1, 2, 4, 6 mesi) - classificazione
PMI continuo (giorni) - regressione
Training:
- Cross-validation (leave-one-pig-out)
- Feature importance (Gini decrease/permutation)
- Hyperparameter tuning (ntree, mtry)
7.3 Model comparison
Modelli separati:
- RF bacteria-only
- RF fungi-only
- RF integrated (bacteria+fungi)
- RF functional (PICRUSt+FUNGuild)
- RF multimodal (taxonomy+function+network)
Metriche: R², RMSE, MAE (regressione)
Accuracy, F1-score (classificazione)
7.4 Biomarker identification
Top predictors:
- Bacterial taxa (es. Bacteroides, Gammaproteobacteria)
- Fungal taxa (es. Mortierellaceae, Pyronemataceae)
- Cross-domain ratios (es. Ascomycota/Firmicutes)
- Network hubs
Results
T.B.D.
Discussion and Conclusions
LIMITAZIONI & PROSPETTIVE FUTURE
Limitazioni del dataset originale:
N=4 carcasse (low replicati)
Singola location/stagione (UK, primavera-autunno 2016)
Assenza dati metabolomici diretti
Studi futuri necessari:
Validazione multi-sito (climi diversi)
Integrazione dati viromici/protisti
Esperimenti manipolativi (inoculo funghi → risposta batterica)
Transcriptomics (espressione genica attiva vs DNA residuo)