İnsan Genom Dizileme Maliyetleri

Yeni Nesil Dizileme (NGS)

• İkinci nesil dizileme olarak da tanımlanır.

Toplu paralel (derin) dizileme → genomik araştırmalarda devrim.

• Sanger dizilemeden farkları:

1.Çok miktarda paralel

2.Mikroölçek (çip tabanlı)

3.Daha hızlı

4.Daha düşük maliyetli

5.Daha kısa okuma parçaları (50–700 bp)

NGS – Tarihçe ve Temel Aşamalar

• Kütüphane hazırlama

1.DNA parçalanır, adaptörler eklenir.

2.Amplifikasyon

3.Klonal çoğaltma, PCR.

4.Dizileme

Farklı yöntemler (SBS, ligasyon vb.)

-Shotgun Dizileme

-Genom restriksiyon enzimleriyle küçük parçalara ayrılır.

-Her fragment klonlanır ve dizilenir.

-Bilgisayar çakışmaları birleştirir → tam dizilim.

Dizileme Yöntemlerinin Karşılaştırması

Özellik	Sanger Dizileme	Shotgun Stratejisi	Yeni Nesil Dizileme (NGS)
Prensip	ddNTP ile zincir sonlandırma	Genomu rastgele parçalara ayırıp paralel dizileme (Sanger/NGS ile)	DNA parçaları adaptörlerle çoğaltılır, milyonlarca parça aynı anda dizilenir
Okuma uzunluğu	500–1000 bp	Teknolojiye bağlı: Sanger shotgun → 500–1000 bp; NGS shotgun → 50–300 bp	50–300 bp (Illumina) – kısa ama derin
Hız	Yavaş	Orta (paralel ama Sanger bazlı)	Çok hızlı (yüksek paralellik)
Ölçek	Küçük DNA parçaları, genler	Büyük genom projeleri (ör. İnsan Genomu)	Tüm genom, transkriptom, epigenom, tek hücre
Maliyet	Yüksek	Daha düşük ama hâlâ pahalı	Çok düşük (milyonlarca baz aynı anda)
Kullanım alanı	Küçük ölçekli analiz, mutasyon doğrulama	İnsan Genom Projesi, büyük genom montajı	Klinik tanı, genomik araştırmalar, RNA-seq, metagenomik

Dizileme Teknolojileri

Dizileme Teknolojileri

• 1. Nesil Dizileme (Sanger)
  • Dideoksinükleotid (ddNTP) ile zincir sonlandırma
    
  • 500–1000 bp uzun okuma
    
  • Yavaş ve maliyetli
    
  • Küçük gen bölgeleri, mutasyon doğrulama

Dizileme Teknolojileri (devam)

• 2. Nesil Dizileme (NGS)
  • Yüksek paralellik, düşük maliyet
    
  • Kısa okuma parçaları (50–300 bp)
    
  • Tüm genom, RNA-seq, epigenom analizleri
    
  • Teknolojiler:
    • Hibridizasyon ile dizileme → SOLiD
      
    • Sentezle dizileme → 454 (pirosekanslama), Illumina

Dizileme Teknolojileri (devam)

• 3. Nesil Dizileme
  • Uzun okuma uzunlukları (10–50 kb)
    
  • Tek molekül gerçek zamanlı dizileme
    
  • Teknolojiler:
    • PacBio SMRT → 30–50 kb uzun okuma
      
    • Heliscope → PCR’sız, tek molekül dizileme

Dizileme Teknolojileri (devam)

• 4. Nesil Dizileme
  • Nanopore tabanlı dizileme
    
  • Çok uzun DNA moleküllerini (10–100 kb+) gerçek zamanlı okur
    
  • Amplifikasyonsuz, düşük maliyet
    
  • Teknolojiler:
    • Oxford Nanopore
      
  • Avantaj: Gerçek zamanlı, taşınabilir cihazlarla kullanılabilir

Karşılaştırma

• Nesil Teknoloji Okuma Uzunluğu Avantaj Zorluk

1. Sanger 500–1000 bp Yüksek doğruluk Yavaş, pahalı
2. Illumina 50–300 bp Yüksek verim Kısa okuma
3. PacBio 10–50 kb Uzun okuma Hata oranı yüksek
4. Nanopore 10–100 kb+ Gerçek zamanlı Doğruluk sorunları

Dizileme Teknolojilerinin Karşılaştırması

Nesil	Teknoloji(ler)	Okuma Uzunluğu	Avantaj	Zorluk
1. Nesil	Sanger	500–1000 bp	Yüksek doğruluk	Yavaş, pahalı, düşük verim
2. Nesil (NGS)	Illumina, SOLiD, 454 (pirosekanslama)	50–300 bp (Illumina); 400–700 bp (454)	Çok yüksek verim, düşük maliyet	Kısa okumalar, montaj zorluğu
3. Nesil	PacBio SMRT, Heliscope	10–50 kb (PacBio); tek molekül (Heliscope)	Uzun okumalar, PCR’sız	Yüksek hata oranı, maliyetli cihazlar
4. Nesil	Oxford Nanopore	10–100 kb+ (teorik olarak >100 kb)	Gerçek zamanlı, amplifikasyonsuz, taşınabilir cihazlar	Doğruluk sorunları (özellikle homopolimer bölgeler)

Kaynakça

1.TA Brown, Genomlar 3

2.Brigitte Bruijns et al., Electrophoresis 2018

3.Goodwin et al., Nature Reviews 2016

4.Khan Academy – DNA Sequencing