Inleiding

Bètablokkers zijn geneesmiddelen die de bloeddruk verlagen, het hart vertragen en de zuurstofconsumptie van het hart verminderen.
In dit onderzoek worden watervlooien (Daphnia pulex) gebruikt om de effectiviteit en eventuele bijwerkingen te bekijken. Aanvullend wordt er gekeken of de receptoren op het hart van de watervlooien vergelijkbaar zijn met de receptoren op een mensenhart.

Onderzoeksvraag: Op welke manier kunnen watervlooien ingezet worden om het effect van hartmedicatie te onderzoeken?
- Kunnen watervlooien met dit project bijdragen aan de ontwikkeling van dierproefvrije onderzoeken voor onder andere cardiovasculair onderzoek?
- Welk effect hebben verschillende concentraties van bètablokkers op de hartslagfrequentie van watervlooien?
- Bevatten watervlooien een adrenerge receptor op DNA- en eiwitniveau?

In dit deel van het onderzoek is er onderzocht of watervlooien DNA bevatten voor adrenerge receptoren aan de hand van Polymerase Chain Reaction (PCR). Dit wordt gedaan aan de hand van ontworpen primers die een deel van de bètareceptoren amplificeren en zal worden aangetoond aan de hand van een gelelektroforese. Verder wordt er gekeken op eiwit-niveau naar de beta-receptoren van de vlo met een western blot.

Hypothese: Er wordt verwacht dat er aangetoond kan worden dat watervlooien genen bevatten die coderen voor de adrenerge receptoren. Hierbij is de verwachting dat er fragmenten van ongeveer 800-1000 basenparen geamplificeerd worden m.b.v. de ontworpen primers.
Ook wordt er verwacht dat er aangetoond kan worden dat watervlooien bèta 1-adrenerge receptoren heeft. Hierbij is de verwachting dat er fragmenten van ongeveer 51 kDa geïsoleerd zullen worden uit de watervlooien.

Materiaal en methode

DNA-isolatie
Er werden 100-200 watervlooien gefilterd en in een potterbuis gebracht. Hieraan werd PBS toegevoegd als homogenisatie buffer om het DNA te verkrijgen. De suspensie die verkregen was werd hierna zoveel mogelijk op ijs bewaard.
De suspensie werd in een steriele buis overgebracht en gedurende 10 minuten bij 3000 × g gecentrifugeerd. Van het supernatant is een deel overgebracht naar een nieuwe buis. Na het toevoegen van Proteinase K en Buffer AL (zonder ethanol) werd het mengsel zorgvuldig gemengd door te vortexen. Daarna werd alles 10 minuten op 56 °C geïncubeerd om eiwitten te verwijderen en het DNA verder te verspreiden.
Na incubatie werd het volledige mengsel, inclusief eventuele neerslag, op een DNeasy Mini Spin Column gepipetteerd en werd deze in een opvangbuis geplaatst. De kolom werd gedurende 1 minuut gecentrifugeerd bij een constante van >6000 × g, waarna de doorstroomvloeistof en de opvangbuis werden weggegooid. De kolom werd daarna twee keer gewassen: eerst met Buffer AW1 en vervolgens met Buffer AW2, waarbij telkens werd gecentrifugeerd (respectievelijk bij >6000 × g en 20.000 × g). Deze wasmethoden waren bedoeld om vervuiling te verwijderen. Voor de elutie van het DNA werd de kolom verplaatst naar een schone buis. Er werd Buffer AE rechtstreeks op de kolom gepipetteerd, waarna er een incubatie van 1 minuut op kamertemperatuur werd uitgevoerd en er gedurende 1 minuut bij >6000 × g werd gecentrifugeerd. Deze elutiestap werd herhaald met hetzelfde buisje en vloeistof om de DNA-opbrengst te verhogen. Uiteindelijk werd de concentratie en zuiverheid van het geïsoleerde DNA vastgesteld met een Nanodrop spectrofotometer. De waarden die werden verzameld, werden vastgelegd in het labjournaal en het DNA werd gebruikt voor een PCR.

Na het uitvoeren van de bovenstaande stappen werden er geen resultaten verkregen. Hierom werd er besloten om het een tweede keer uit te voeren om te kijken of er ergens in het proces een misstap is gezet. Daarnaast werd van zowel de eerste keer als de tweede keer ook het genomische DNA op gel gezet. Dit kon omdat van beiden keren het genomische DNA bewaard is gebleven.

PCR
Er werden vijf primerparen getest (Daphnia 1: Beta1, Daphnia 2: Beta2, Daphnia 3: Beta3, Daphnia 4: Actine, Daphnia 5: GAPDH), waaronder twee voor de huishoudgenen GAPDH en Actine van watervlooien. In de samples werd er in een mastermix een PCR-buffer en water toegevoegd. Er werden vijf (één voor elk primerpaar) samples gemaakt met het geïsoleerde DNA en daarnaast werden er vijf watercontroles gedaan. De PCR werd uitgevoerd op een vast programma met een annealingstemperatuur van 50 °C.

Analyse van de PCR-producten
Voor het analyseren van de PCR-producten werden de samples op een gel geladen. Hiervoor werd een 1% agarosegel en een 1x TAE-buffer gemaakt. De agarose werd opgelost in de buffer, waarna er SYBR-Safe aan werd toegevoegd. Deze oplossing werd gegoten in een gelelektroforesebak met een kam met twintig slotjes. Eventuele luchtbellen werden weggehaald aan de hand van pipetpuntjes. Nadat de gel was gestold, was deze klaar voor gebruik voor de gelelektroforese.
De samples werden geprepareerd door de juiste hoeveelheid loading buffer toe te voegen. Daarna werden de samples op de agarosegel geladen door te pipetteren in de slotjes. Naast de samples werden ook twee DNA-markers op de gel gepipetteerd: een λ-DNA marker geknipt met PstI en een Bench Top Ladder DNA-marker. Er werden twee markers gebruikt om grotere en kleinere fragmenten beter van elkaar te kunnen onderscheiden. De agarosegel werd gerund op 120 volt gedurende ongeveer één uur. Hierna werd de gel onder UV-licht bekeken.

Eiwitisolatie
Als eerste is er 2 ml lysisbuffer gemaakt door middel van een pipetteerschema, daarna is er 300 µl van de buffer in een epje toegevoegd en geresuspendeerd zodat het pellet onder in het epje goed oplost. Vervolgens is het epje 5 seconden op de vortex gezet, om het daarna te incuberen op ijs. Hierna is een grote hoeveelheid watervlooien op een filter aangebracht om deze van het water te scheiden. Daarna zijn de vlooien in een schone Potter-buis gezet. Hier is 0,5 ml lysisbuffer toegevoegd waarna de watervlooien vermaald zijn tot er een oplossing was gevormd. Daaropvolgend is deze oplossing op ijs gezet om dit goed te bewaren. Vervolgens is 300 µl van deze oplossing overgebracht in een schoon epje en is deze tegelijkertijd met de controlesample gecentrifugeerd voor 10 minuten op 13.000 g. Hierna is 75 µl overgebracht naar een schoon epje. Vervolgens is er 75 µl Laemmli-buffer aan de samples toegevoegd, waarna ze 10 minuten geïncubeerd zijn op 95 °C. Als laatste was het belangrijk dat de samples bewaard werden in de vriezer.

SDS-page
De voorverpakte gel werd bereid samen met een 10x geconcentreerde TGS running buffer. Er werd 5 µl van de marker opgebracht en 20 µl van de monsters. De gel werd gerund op 120 volt voor ongeveer 30-45 minuten.

Western Blot
De gel werd uit de cassette gehaald en gemarkeerd om de oriëntatie te kunnen herkennen. In een bakje demiwater werd de gel natgehouden. Er werd gebruik gemaakt van acht Whatman 3M velletjes en één NC-membraan. Nadat deze velletjes in transfer buffer (1x TrisGlycine buffer met 20% methanol) werden gedompeld, werd er een cassette gebruikt om te blotten. Hier werd er een sandwich gemaakt van vier Whatman 3M vellen, de gerunde gel, het NC-membraan en daarna weer vier Whatman 3M vellen. Hierbij werd ervoor gezorgd dat het NC-membraan richting de positieve pool zat.
Na de elektrotransfer werd het overtollige membraan weggesneden, naast dat er markeringen werden aangebracht voor de oriëntatie.

Ponceau S kleuring
Na het spoelen van het membraan met demiwater, werd er Ponceau S kleuring op het membraan gegoten totdat deze volledig was bedekt. Dit werd geïncubeerd totdat er bandjes te zien waren of totdat het membraan rood/roze was gekleurd. Hierna werd het membraan weer gespoeld met demiwater om de achtergrondkleuring weg te spoelen en de bandjes duidelijker zichtbaar te maken. Bij het bewaren van het membraan werd deze in een 50 ml buis 0,1% Triton X-100 in PBS gedaan.

Kleuring van blot met antilichamen tegen bètareceptoren
Als eerste werd het membraan 10 minuten in 10 ml blokbuffer (5% non-fat dry milk in PBS) geïncubeerd. Na wassen met 10 ml wasbuffer (0,5% non-fat dry milk; 0,1% Triton X-100 in PBS) werd het membraan 60 minuten geïncubeerd in een 1:2000 verdunning van het eerste antilichaam (Konijn-Anti-BETA1) op een rollerbank. Daarna werd het membraan opnieuw drie keer gewassen met 10 ml wasbuffer, die na elke wasstap werd vervangen. Toen werd de membraan 30-45 minuten geïncubeerd in een 1:5000 verdunning van het tweede antilichaam (Geit anti-konijn HRP geconjugeerd). Daarna werd het membraan opnieuw gewassen: eerst drie keer met wasbuffer en daarna twee keer met PBS.
Als laatste werd er TMB-substraat op het membraan gepipetteerd en dit werd geïncubeerd totdat er banden zichtbaar werden. Het kleuringsproces werd gestopt door het membraan te spoelen met leidingwater.

Data-analyse
De gel en het NC-membraan werden afgelezen door de grootte van de bandjes te bepalen aan de hand van de marker(s).

Resultaten

DNA- isolatie
Eerst werd het DNA gefilterd om het zo zuiver mogelijk te krijgen. Vervolgens was een Nanodrop-analyse uitgevoerd om de DNA-concentratie en de zuiverheid van het mengsel te beoordelen. De 260/280-ratio, die wordt gebruikt om de zuiverheid van het DNA-mengsel te bepalen, was met een waarde van 1,89 lager dan de ideale waarde van ongeveer 2,2. Dit kan wijzen op mogelijke contaminatie van het DNA. Daarnaast bedroeg de DNA-concentratie 8,9 ng/µl, wat in de praktijk relatief laag is.

Nadat de nanodrop uitgevoerd was kon er een PCR gedaan worden. Deze PCR-resultaten werden op een gel geladen.

Om te bevestigen dat de DNA-fragmenten daadwerkelijk gerepliceerd waren en een lengte hadden tussen de 800 en 1000 basenparen, waren verschillende samples geplaatst op een 1% agarosegel (afbeelding 1).

Laantjes 1 t/m 5 hadden bandjes moeten vertonen met een grootte tussen de 800 en 1000 baseparen, maar er waren geen bandjes zichtbaar.

Laantjes 9 t/m 13 dienden als negatieve controles om te verifiëren dat er geen DNA aanwezig was in de primers, buffer of MilliQ. In deze laantjes waren eveneens geen bandjes waargenomen.

In de laantjes 17 en 19 zat genomisch-DNA. Hiervan was het DNA in laantje 17 van de eerste de DNA- isolatie die werd uitgevoerd en laantje 19 van de tweede keer dat deze werd uitgevoerd. Bij laantje 17 was er wel een bandje te zien op een grootte van 11501 bp. Bij laantje 19 werd er daarentegen niks gezien.

Het genomische DNA was zichtbaar als een heldere en duidelijke band in de gel. Dit geeft aan dat het DNA goed was geïsoleerd en vrij van verontreinigingen zoals RNA of eiwitten. De scherpte en intensiteit van de band laten zien dat het genetisch materiaal van hoge kwaliteit is, wat belangrijk is voor verdere analyses zoals sequencing of PCR.

hier hoort een afbeelding te staan, echter lukt het mij niet om deze in de Rstudio computer versie erin te zetten. Hierom verwijs ik graag door naar afbeelding 1 in het word document.

Eiwitisolatie
De geïsoleerde eiwitsamples werden als eerst op een SDS-page geladen, zodat de eiwitten gescheiden konden worden van elkaar op basis van hun grootte. Deze SDS-page gel werd daarna geladen op een membraan waarop de eiwitten aangekleurd konden gaan worden. Als eerst werd er een Ponceau S kleuring gedaan waarbij de eiwitten op het membraan rood gekleurd zouden moeten worden. Echter werd er totaal geen kleuring van het membraan gezien, ook niet in de markers. De laantjes waren compleet wit gebleven en toonden dus aan dat er geen eiwitten op het membraan aanwezig waren (afbeelding 2). Ook was er te zien dat de marker vrij ongelijk liep en niet volledig gezien werd op de gel.

hier hoort een afbeelding te staan, echter lukt het mij niet om deze in de Rstudio computer versie erin te zetten. Hierom verwijs ik graag door naar afbeelding 2 in het word document.

Om er zeker van te zijn dat er daadwerkelijk geen eiwitten op het membraan aanwezig waren werd er ook nog een kleuring met antilichamen gedaan. Ook bij deze kleuring kwamen er geen zichtbare eiwit bandjes op de membraan tevoorschijn. De markers waren ook scheef en liepen niet veel verder door dan ongeveer 50 kDa (afbeelding 2).

hier hoort een afbeelding te staan, echter lukt het mij niet om deze in de Rstudio computer versie erin te zetten. Hierom verwijs ik graag door naar afbeelding 3 in het word document.

Conclusie

Het doel van deze experimenten was om te bepalen of de Daphnia pulex genen heeft die adrenerge receptoren tot expressie brengen. Dit werd gedaan aan de hand van DNA-isolatie waarop een PCR is uitgevoerd waarvan de resultaten visueel zijn weergegeven op een gel.
Ook werd er gekeken naar hoe deze adrenerge receptoren eruit zouden zien op een westernblot en hoe groot zij zouden zijn.

DNA-isolatie
De uitkomsten van de Nanodrop na de DNA-isolatie wijzen erop dat het DNA vrij zuiver is. De ratio van 260/280 is namelijk 1,89. Voor zuiver DNA zou deze waarde tussen de 1,8 en 2,2 moeten liggen, wat betekent dat onze waarde net tussen deze referentiewaarden ligt. Bovendien is de DNA-concentratie met 8,9 ng/μl relatief laag.

Er werd verwacht dat het genomisch DNA van de eerste uitvoering gegarandeerd een bandje op de gel zou vertonen, aangezien de concentratie hoger was dan 10 ng/μl en dus voldoende zou moeten zijn voor een duidelijk resultaat. Er is dan ook een bandje te zien van rond de 11501 bp. In laan 19 is het genomisch DNA te zien van de tweede uitvoering, waarbij de concentratie rond de 8,9 ng/µl DNA lag. In dit laantje is geen bandje te zien voor genomisch DNA. Dit komt waarschijnlijk omdat de DNA-concentratie lager was dan het eerste protocol.

Het is onduidelijk of de PCR succesvol is uitgevoerd. Op de gel zijn er geen banden te zien voor de primers en DNA-combinaties, wat betekent dat er geen conclusies kunnen worden getrokken over de aanwezigheid van PCR-producten. Mogelijk is dat de fragmenten te klein waren om te worden waargenomen, maar dit is onwaarschijnlijk, omdat de primers wel aangekleurd waren op de gel en deze de kleinste fragmenten vormen. De gelelektroforese is echter wel goed uitgevoerd, wat blijkt uit de heldere en goed leesbare DNA-markers en de dikke banden onderaan de gel die de primers aantonen.

Wel is er in laantje 17 een bandje te zien (afbeelding 1). Dit laantje was geladen met onverdund genomisch-DNA van de eerste uitvoering van het protocol. Hieruit is de concluderen dat de isolatie van het DNA wel goed is gegaan. Dit product is zeer groot, omdat deze is af te lezen bij een grootte van ongeveer 11501 bp.

Eiwitisolatie
Als er gekeken wordt naar de membraan na de verschillende kleuringen dan is er één ding met duidelijkheid te zeggen en dat is dat er geen eiwitten gekleurd zijn. De Ponceau S kleuring toonde meteen al aan dat er geen eiwitten op de membraan aanwezig waren. Dit betekende ook dat er niks gekleurd zou worden met de verschillende antilichamen. De gel heeft wel gelopen, omdat de eiwitmarkers wel gescheiden zijn van elkaar. Het kan dus zo zijn dat de Daphnia pulex geen bèta 1-adrenerge receptoren heeft.

Omdat er geen bandjes zijn aangetoond, kan er geen vergelijking worden gemaakt met de hypothese en verwachting.

Discussie

DNA-isolatie
Uit de resultaten blijkt dat er ergens binnen de protocollen iets niet 100% effectief is. Om eventuele verbeteringen aan het protocol te formuleren, zijn er diverse literaire bronnen van eerder uitgevoerde experimenten onderzocht. Er zijn diverse mogelijke aanpassingen ontwikkeld op basis van deze literatuur:

Een mogelijke oorzaak van de zeer lage DNA-opbrengst kan het DNA-isolatieprotocol zijn geweest. Als het protocol wordt vergeleken met eerdere experimenten van anderen, zijn er diverse stappen waar wij niet aan hebben gewerkt. De dieren worden vaak eerst vrijgemaakt van microben d.m.v. antibiotica, waarna ze gedehydrateerd worden en met vloeibaar stikstof worden ingevroren. Voor een experiment op onze grootte zouden deze wijzigingen niet haalbaar zijn. Een mogelijke aanpassing voor studenten zouden langere wachttijden zijn na het toevoegen van Proteinase K en Buffer AL. Een laatste verandering die nog steeds haalbaar is, zou het toevoegen van koude isopropanol zijn, zodat het DNA kan neerslaan en het supernatant met vervuiling kan worden afgepipetteerd (Angst, 2024).

Het protocol voor de PCR bleek uiteindelijk niet effectief te zijn. De annealing temperatuur was niet ideaal. De temperatuur die werd vastgesteld voor de annealing was 47 °C, terwijl de PCR-machine was ingesteld op 50 °C. Het is onwaarschijnlijk dat dit veel impact heeft gehad, maar het zou wellicht een factor kunnen zijn geweest. Dit had kunnen leiden tot een tekort aan binding van de primers, wat resulteerde in een slechte uitvoering van de elongatiestap. Wanneer dit experiment opnieuw wordt uitgevoerd, zou het raadzaam zijn om de annealing stap daadwerkelijk op 47 °C te uit te voeren.

Ook zou het reëel zijn om andere primers te gebruiken voor het PCR-programma. De gebruikte primers hebben waarschijnlijk geen bindingsplaatsen op het genomisch DNA, waardoor er dus ook geen PCR-producten op de gel te zien zijn. Andere primers zouden opgezet kunnen worden a.d.h.v. de bioinformatica lessen of door te kijken naar eerder geschreven literatuur.

Het DNA-elektroforese protocol is goed verlopen. Dit omdat de primers duidelijk zichtbaar zijn als dikke banden onder in de gel.

Eiwitisolatie
Zoals te zien was in afbeelding 2 en 3 waren er geen eiwitten op het membraan aantoonbaar en waren de eiwitmarkers tevens ook erg uitgelopen en scheef. Een mogelijke reden hiervoor kan zijn geweest dat het runnen van de SDS-page is uitgevoerd op 200 volt, i.p.v. de aangegeven 120 volt zoals in het protocol stond beschreven. De marker heeft hierdoor niet genoeg tijd gehad om netjes te scheiden en zijn er hierdoor grote vlekken ontstaan zijn op de plekken van de markerbandjes. De reden waarom er geen eiwitten op het membraan zitten kan mogelijk de concentratie eiwit zijn geweest die in de monsters aanwezig was. Er is niet gemeten wat deze concentratie was, maar ook vanuit eerder onderzoek tijdens de DNA-isolatie merkte we dat er maar een lage opbrengst was na het isoleren. Ook was de Ponceau S kleuring al erg verdund op het moment dat wij deze gingen gebruiken. Wij stonden als één van de laatste projectgroepen op het lab en de Ponceau S die in de fles zat was dus al sterk verdund met demiwater. Net als bij het eerdergenoemde DNA-isolatie protocol zou een mogelijke aanpassing dus kunnen zijn om dieren vrij te maken van microben, te dehydrateren en in te vriezen met vloeibaar stikstof. Langere wachtstappen, net als bij het DNA-protocol, zouden ook een reële oplossing zijn.

Bijlagen

Bijlagen worden ingeleverd op canvas samen met het meetrapport in een word bestand.

Angst, P. (2024, 23 april). DNA-extraction of Daphnia and symbionts. protocols.io. https://www.protocols.io/view/dna-extraction-of-daphnia-and-symbionts-5jyl82n96l2w/v1