El análisis por citometría de flujo de poblaciones de monocitos y macrófagos humanos ha experimentado avances significativos en 2024-2025, con nuevas combinaciones de marcadores que logran una precisión del 94-99% en la identificación de subpoblaciones comparado con los enfoques tradicionales [1,2]. El campo ha evolucionado más allá de la clasificación simple CD14/CD16 hacia paneles multiparamétricos comprensivos y estandarizados que integran marcadores establecidos y emergentes para un fenotipado preciso [3].
La identificación de subpoblaciones de monocitos ahora se basa en la clasificación validada de tres subconjuntos que se mantiene como base para el análisis de monocitos, pero los esfuerzos de estandarización recientes han mejorado dramáticamente la reproducibilidad [1]. Los monocitos clásicos (CD14++CD16-, ~85% del total) representan los principales respondedores inflamatorios con alta expresión de CCR2 para reclutamiento tisular [5]. Los monocitos intermedios (CD14++CD16+, ~5%) muestran la mayor expresión de HLA-DR y capacidades especializadas de presentación de antígenos [5,7]. Los monocitos no clásicos (CD14+/dimCD16++, ~10%) funcionan como células de patrullaje vascular con alta expresión de CX3CR1 [5,6].
Las estrategias de discriminación mejoradas ahora incorporan marcadores adicionales más allá de CD14/CD16 [6]. Los estudios de citometría de masas identificaron que agregar CCR2, CD36, HLA-DR y CD11c aumenta la pureza de subconjuntos del ~86-87% al 98.8% para monocitos intermedios y 99.1% para monocitos no clásicos [6]. El Grupo de Trabajo Francés CytHem-LMMC estandarizó exitosamente estos enfoques en casi 50 laboratorios, con sus protocolos ahora integrados en los criterios de clasificación de la OMS para el diagnóstico de leucemia mielomonocítica crónica [1].
La clasificación tradicional M1/M2 usando iNOS/Arginasa-1 ha sido ampliamente superada por nuevos sistemas de discriminación CD38/Egr2 [8,9]. La investigación reciente demuestra que CD38+Egr2- identifica macrófagos M1 con 94.9% de precisión, mientras que CD38-Egr2+ identifica macrófagos M2 con 93.9% de precisión [9]. Esto representa una mejora significativa sobre los marcadores clásicos, con CD38 ofreciendo la ventaja de expresión superficial adecuada para análisis de células vivas [9].
La identificación de macrófagos M1 ahora se basa en marcadores de superficie CD38, CD80, CD86 y CD64, suplementados por iNOS intracelular y citocinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β, IL-6) [8,9]. La identificación de macrófagos M2 utiliza CD163 (receptor carroñero), CD206 (receptor de manosa) y el nuevo marcador intracelular Egr2, que muestra especificidad superior comparado con Arginasa-1 (70% vs 24% de células positivas respectivamente) [9,10].
El campo reconoce cada vez más que M1/M2 representa un espectro más que categorías discretas [8,13]. El análisis avanzado revela macrófagos asociados a tumores, macrófagos reguladores y subconjuntos definidos metabólicamente que no encajan en las clasificaciones tradicionales, requiriendo paneles de marcadores más amplios para caracterización comprensiva [13].
Panel básico recomendado de 8 colores incorpora: CD14-APC-H7, CD16-BV510, CD64-BV421, HLA-DR-PerCP-Cy5.5, CD163-PE, CD206-APC, CD169-BB515, y marcadores de exclusión de linaje (CD20/CD3/CD56)-AF700 [2,15]. Esta configuración proporciona identificación robusta de subconjuntos de monocitos mientras detecta marcadores tempranos de diferenciación de macrófagos [2].
Panel comprensivo extendido de 12 colores añade CD11c-PE-Cy7, CCR2-BV605, CD36-AF488 y marcadores Live/Dead para discriminación mejorada [2]. Para aplicaciones de investigación, la citometría de flujo espectral permite paneles de 20+ colores que analizan simultáneamente múltiples estados funcionales, marcadores de activación y etapas de diferenciación [4,11,12].
Consideraciones técnicas críticas incluyen bloqueo obligatorio de Fc usando BD MonoBlock™ o BioLegend TruStain Monocyte Blocker™ para prevenir unión no específica de tintes tándem [3]. La selección de fluorocromos requiere tintes brillantes (PE, APC, Brilliant Violet) para antígenos débiles y compensación cuidadosa de spillover, particularmente para tintes tándem en monocitos/macrófagos [3].
Clones de anticuerpos esenciales con fiabilidad probada incluyen: CD14 (Clon M5E2 o MφP9), CD16 (Clon 3G8 - más ampliamente validado), CD68 (Clon Y1/82A para especificidad mejorada sobre KP-1), CD163 (Clon GHI/61), HLA-DR (Clon G46-6 o L243), CD64 (Clon 10.1), y CD206 (Clon 19.2) [1,2,15]. Estos clones han sido sometidos a validación extensiva en múltiples plataformas y muestran rendimiento consistente en entornos clínicos y de investigación [1,3].
Los protocolos de tinción intracelular requieren fijación con paraformaldehído al 4% seguida de permeabilización con saponina al 0.1% para marcadores como CD68, Arginasa-1 y Egr2 [3]. Los enfoques novedosos de citometría de flujo de ARNm usando tecnología PrimeFlow permiten detección de ARNm de CD163 en células vivas, combinando análisis de proteínas y ARNm en flujos de trabajo únicos [3].
El enfoque de gate secuencial sigue: exclusión de dobletes (FSC-A vs FSC-H), selección de tamaño/granularidad (FSC-A vs SSC-A), gate de viabilidad, exclusión de linaje (CD3-CD19-CD56-CD66b-), selección HLA-DR+, identificación CD14+, y finalmente discriminación de subconjuntos CD14 vs CD16 [1,15]. La adquisición mínima requiere 10,000 eventos de monocitos para cuantificación confiable, con adquisición dentro de 4 horas de la recolección de sangre [3,15].
Las medidas críticas de control de calidad incluyen estandarización diaria del instrumento usando perlas de calibración, controles FMO para gate preciso (especialmente para marcadores débiles), y controles inter-ensayo con muestras de donantes normales [3]. El procesamiento de muestras debe evitar procedimientos de lavado que alteren la expresión de CD16 y utilizar tinción en sangre total a 4°C para minimizar artefactos de activación [1,14].
Los macrófagos circulantes representan un desafío distinto ya que los verdaderos macrófagos tisulares rara vez circulan en individuos sanos [8]. El análisis típicamente se enfoca en macrófagos derivados de monocitos generados a través de protocolos de diferenciación in vitro de 7-9 días [8]. El análisis de curso temporal revela expresión óptima de marcadores: CD38 alcanza su pico a las 6-24 horas para activación M1, mientras que la expresión de Egr2 se estabiliza a las 24-72 horas para identificación M2 [9].
Los marcadores de diferenciación que rastrean la progresión monocito-a-macrófago incluyen expresión decreciente de CD14, adquisición creciente de CD16 y upregulación de CD64 [7,13]. La identificación específica de macrófagos se basa en combinaciones CD68+HLA-DR+, con CD163 y CD206 proporcionando indicación de sesgo M2 y CD80/CD86 sugiriendo activación tipo M1 [8,10].
Los marcadores de superficie novedosos incluyen CD38 para identificación M1 (superior a iNOS intracelular), GPR18 y FPR2 mostrando upregulación de 35-100 veces en condiciones M1, y CD209 correlacionando directamente con capacidad fagocítica [9]. La discriminación avanzada incorpora SLAN para subdivisión de monocitos no clásicos, MerTK para identificación de macrófagos tisulares, y CD115 para análisis de vía de diferenciación M2 mediada por receptor M-CSF [6,13].
La citometría de flujo espectral permite paneles sin precedentes de 48 marcadores analizando >58 fenotipos celulares simultáneamente [11,12], mientras que las aplicaciones de aprendizaje automático logran >90% de precisión en discriminación M1/M2 basada en morfología usando enfoques de autofluorescencia celular libres de marcaje [12].
| Función | Marcador | Especificidad | Clon Recomendado | Fluorocromo Sugerido | Expresión | Ref |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Identificación Básica | CD14 | Pan-monocito | M5E2, MφP9 | APC-H7, PerCP-Cy5.5 | Alta en clásicos | [1,5] |
| CD16 | Monocitos int/no clásicos | 3G8 | BV510, PE-Cy7 | Alta en no clásicos | [1,5] | |
| HLA-DR | Presentación antígenos | G46-6, L243 | PerCP-Cy5.5, BV421 | Muy alta en intermedios | [5,7] | |
| Subpoblaciones | CCR2 | Monocitos clásicos | K036C2 | BV605, AF647 | Alta en clásicos | [5,6] |
| CX3CR1 | Monocitos no clásicos | 2A9-1 | PE, AF488 | Alta en no clásicos | [5,6] | |
| CD36 | Función metabólica | 5-271 | AF488, PE | Variable | [6,7] | |
| CD11c | Células dendríticas/monos | 3.9 | PE-Cy7, BV711 | Intermedia | [6,7] | |
| Macrófagos M1 | CD38 | Activación M1 | HIT2 | BV421, AF647 | Muy alta M1 | [8,9] |
| CD80 | Coestimulación | 2D10 | PE, BV605 | Alta M1 | [8,9] | |
| CD86 | Coestimulación | IT2.2 | AF700, BV711 | Alta M1 | [8,9] | |
| iNOS | Función M1 (IC) | Policlonal | AF488, PE | Solo M1 | [9,10] | |
| Macrófagos M2 | CD163 | Receptor carroñero | GHI/61 | PE, APC | Muy alta M2 | [8,10] |
| CD206 | Receptor manosa | 19.2 | APC, BV605 | Alta M2 | [8,10] | |
| Egr2 | Factor transcripción M2 (IC) | erongr2 | AF488, PE | Solo M2 | [9,10] | |
| CD200R | Receptor inhibitorio | OX-108 | PE, AF647 | Alta M2 | [10] | |
| Diferenciación | CD64 | Receptor Fc gamma I | 10.1 | BV421, PE-Cy7 | Creciente con diferenciación | [7,13] |
| CD68 | Pan-macrófago (IC) | Y1/82A | AF488, PE | Macrófagos maduros | [8,13] | |
| CD169 | Sialoadhesina | 7-239 | BB515, BV605 | Macrófagos tisulares | [13] | |
| Funcionales | CD209 | DC-SIGN | DCN46 | PE, AF647 | Capacidad fagocítica | [9,13] |
| MerTK | Efferocitosis | 2B10C42 | AF647, BV711 | Macrófagos tisulares | [13] | |
| CD115 | Receptor M-CSF | 9-4D2-1E4 | PE, BV605 | Diferenciación M2 | [10,13] | |
| Exclusión | CD3 | Linfocitos T | UCHT1 | AF700 | Exclusión | [3,15] |
| CD19/CD20 | Linfocitos B | HIB19/2H7 | AF700 | Exclusión | [3,15] | |
| CD56 | Células NK | HCD56 | AF700 | Exclusión | [3,15] | |
| CD66b | Neutrófilos | G10F5 | AF700 | Exclusión | [3,15] |
IC: Intracelular; Int: Intermedios; Monos: Monocitos; Ref: Referencias
Los protocolos actuales de citometría de flujo para análisis de monocitos y macrófagos en sangre periférica humana han logrado precisión notable a través de combinaciones de marcadores estandarizadas, estrategias de discriminación novedosas y enfoques técnicos avanzados [1,2,3]. La integración de sistemas CD38/Egr2, paneles espectrales comprensivos y protocolos estandarizados proporciona a los investigadores herramientas robustas para fenotipado preciso [8,9,11]. Los factores clave de éxito incluyen adherencia a protocolos validados, implementación apropiada de control de calidad, y reconocimiento de que la polarización de macrófagos representa un espectro dinámico que requiere análisis multiparamétrico más que clasificación binaria simple [8,13].
El campo continúa avanzando hacia mayor estandarización y utilidad clínica mientras mantiene flexibilidad de investigación a través de citometría espectral e integración de análisis computacional [11,12], estableciendo una base sólida tanto para investigación básica como aplicaciones de diagnóstico clínico [1,3].
[1] Tarfi R, et al. Technical, gating and interpretation recommendations for the partitioning of circulating monocyte subsets assessed by flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 2024;106(1):22-35.
[2] Hally KE, et al. OMIP 083: A 21-marker 18-color flow cytometry panel for in-depth phenotyping of human peripheral monocytes. Cytometry Part A. 2022;101(12):1039-1043.
[3] Cossarizza A, et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). European Journal of Immunology. 2021;51(12):2708-3145.
[4] Lambooij JM, et al. OMIP-104: A 30-color spectral flow cytometry panel for comprehensive analysis of immune cell composition and macrophage subsets in mouse metabolic organs. Cytometry Part A. 2024;105(8):567-575.
[5] Ziegler-Heitbrock L, et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 2011;118(5):e16-e31.
[6] Wong KL, et al. Human blood monocyte subsets: a new gating strategy defined using cell surface markers identified by mass cytometry. European Journal of Immunology. 2018;48(3):394-406.
[7] Boyette LB, et al. Phenotype, function, and differentiation potential of human monocyte subsets. PLOS One. 2017;12(4):e0176460.
[8] Martinez FO, Gordon S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Reports. 2014;6:13.
[9] Jablonski KA, et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLOS One. 2015;10(12):e0145342.
[10] Rőszer T. Understanding the mysterious M2 macrophage through activation markers and effector mechanisms. Mediators of Inflammation. 2015;2015:816460.
[11] Spectral Flow Cytometry Methods and Pipelines for Comprehensive Immunoprofiling of Human Peripheral Blood and Bone Marrow. Cancer Research Communications. 2024;4(3):895-908.
[12] Development of a Spectral Flow Cytometry Analysis Pipeline for High-dimensional Immune Cell Characterization. Journal of Immunology. 2024;213(11):1713-1725.
[13] Monocyte Differentiation and Heterogeneity: Inter-Subset and Interindividual Differences. International Journal of Molecular Sciences. 2023;24(10):8757.
[14] An Unbiased Flow Cytometry-Based Approach to Assess Subset-Specific Circulating Monocyte Activation and Cytokine Profile in Whole Blood. Frontiers in Immunology. 2021;12:641224.
[15] Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. 2018;140:e57941.