Gegevens

studentnummers:

leerteam: VL1212A - Cardiovasculair

cursus: 2024_TLSC-HUZI-24_3_V

tutor: Wouter Hendriksen

Inleiding

In dit onderzoek worden er bètablokkers op watervlooien (Daphnia Pulex) getest. Bètablokkers zijn geneesmiddelen die de bloeddruk verlagen, het hart vertragen en de zuurstofconsumptie van het hart verminderen.
Er worden verschillende bètablokkers getest op watervlooien om de effectiviteit en eventuele bijwerkingen te bekijken. Verder wordt er gekeken naar de receptoren op het hart van de watervlooien en of deze vergelijkbaar zijn met de receptoren op een mensenhart.

Onderzoeksvraag: Op welke manier kunnen watervlooien ingezet worden om het effect van hartmedicatie te onderzoeken?

In dit deel van het onderzoek is er onderzocht of watervlooien adrenerge receptoren tot expressie kunnen brengen aan de hand van Polymerase Chain Reaction (PCR). Dit wordt gedaan aan de hand van ontworpen primers die een deel van de bètareceptoren amplificeren.

Hypothese

Er wordt verwacht dat er aangetoond kan worden dat watervlooien genen bevatten die adrengere receptoren tot expressie brengen. Hierbij is de verwachting dat er fragmenten te zien zullen zijn van ongeveer 800-1000 basenparen bij de reacties die primers en het DNA van de watervlooien bevatten.

Materiaal en Methode

DNA-isolatie van Daphnia pulex

Er werden 100-200 watervlooien gefilterd en in een potterbuis gebracht. Hieraan werd PBS toegevoegd als homogenisatie buffer om het DNA te verkrijgen. De suspensie die verkregen was werd hierna zoveel mogelijk op ijs bewaard.

De suspensie werd in een steriele buis overgebracht en gedurende 10 minuten bij 3000 × g gecentrifugeerd. Van de supernatant is een deel verwijderd en naar een nieuwe buis overgebracht. Er werd Proteinase K en Buffer AL (zonder ethanol) toegevoegd. Het mengsel werd zorgvuldig gemengd door te vortexen en daarna 10 minuten op 56 °C geïncubeerd om eiwitten te verwijderen en het DNA verder te verspreiden.

Na incubatie werd het volledige mengsel, inclusief eventuele neerslag, op een DNeasy Mini Spin Column gepipetteerd en werd in een opvangbuis geplaatst. De kolom werd gedurende 1 minuut gecentrifugeerd bij een constante van >6000 × g, waarna de doorstroomvloeistof en de opvangbuis werden weggegooid. De kolom werd daarna twee keer gewassen: eerst met Buffer AW1 en vervolgens met Buffer AW2, waarbij telkens werd gecentrigfugeerd (respectievelijk bij >6000 × g en 20.000 × g). Deze wasmethoden waren bedoeld om vervuiling te verwijderen . Voor de elutie van het DNA werd de kolom verplaatst naar een schone buis. Er werd Buffer AE rechtstreeks op de kolom gepipetteerd, waarna er een incubatie van 1 minuut op kamertemperatuur werd uitgevoerd en er gedurende 1 minuut bij >6000 × g werd gecentrifugeerd. Deze elutiestap werd herhaald met hetzelfde buisje en vloeistof om de DNA opbrengst te verhogen. Uiteindelijk werd de concentratie en zuiverheid van het geïsoleerde DNA vastgesteld met een Nanodrop spectrofotometer. De waarden die werden verzameld, werden vastgelegd in het labjournaal en het DNA werd gebruikt voor een PCR.

PCR

Met het geïsoleerde DNA werden er PCR-samples klaargemaakt. Er werden vijf primerparen getest, waaronder twee voor de huishoudgenen GAPDH en Actine van watervlooien. In de samples werd er in een mastermix een PCR-buffer en water toegevoegd. Er werden vijf (één voor elk primerpaar) samples gemaakt met het geïsoleerde DNA en daarnaast werden er vijf watercontroles gedaan. De PCR werd uitgevoerd op een vast programma met een annealingstemperatuur van 51 °C.

Figuur 1: Het PCR programma dat uitgevoerd is op de PCR samples.
Figuur 1: Het PCR programma dat uitgevoerd is op de PCR samples.

Analyse van de PCR-producten

Voor het analyseren van de PCR-producten werden de samples op een gel geladen. Hiervoor werd een 1% agarosegel en een 1x TAE-buffer gemaakt. De agarose werd opgelost in de buffer, waarna er SYBR-Safe aan werd toegevoegd. Deze oplossing werd gegoten in een gelelektroforesebak met een kam met twintig slotjes. Eventuele luchtbellen werden weggehaald aan de hand van pipetpuntjes. Nadat de gel was gestold, was deze klaar voor gebruik voor de gelelektroforese.

De samples werden geprepareerd door de juiste hoeveelheid loading buffer toe te voegen. Daarna werden de samples op de agarosegel geladen door te pipetteren in de slotjes. Naast de samples werden ook twee DNA-markers op de gel gepipetteerd: een λ-DNA marker geknipt met PstI en een Bench Top Ladder DNA-marker. Er werden twee markers gebruikt om grotere en kleinere fragmenten beter van elkaar te kunnen onderscheiden. De agarosegel werd gerund op 120 volt gedurende ongeveer één uur. Hierna werd de gel onder UV-licht bekeken.

Data-analyse

De gel werd bekeken en de grootte van de bandjes werd geannoteerd op de afbeelding die werd gemaakt.

Resultaten

Als eerste hebben we het DNA gefilterd om dit zo puur mogelijk te maken. Nadat dit was gebeurd, is er een Nanodrop gedaan om te kijken naar de DNA-concentratie en de puurheid van het mengsel. De 260/280 ratio, nodig voor het bestuderen van de puurheid van het DNA-mengsel, is zoals te zien 1,44; terwijl deze rond de 1,8 en 2,2 hoort te liggen. Dit kan duiden op DNA-contaminatie. De concentratie van het DNA ligt op 13,5 ng/µl dit is in de praktijk al relatief laag, maar wanneer deze vergeleken werd met andere groepen was dit de hoogste DNA concentratie.

Figuur 2: De nanodrop waarp de A260/A280 ratio en de concentratie in ng/µl zijn weergegeven.

Nadat de nanodrop uitgevoerd was kon er een PCR gedaan worden. Deze PCR resultaten werden op een gel geladen.


Figuur 3: 1% agarosegel waarop verschillende samples en markers geladen zijn. In de legenda naast de gel is te zien wat er in welk laantje is geladen en de groottes van de bandjes worden weergegeven in baseparen.

Om te weten te komen of de DNA-fragmenten ook daadwerkelijk gerepliceerd zijn en tussen de 800 en 1000 basenparen lang zijn, zijn er verschillende samples op een 1% agarosegel gezet (afbeelding 1). Verwacht werd dat het pure DNA met zekerheid een bandje op de gel zou laten zien, omdat deze meer dan 10 ng/μl in concentratie was en dus genoeg had moeten zijn voor een duidelijk resultaat. In laan 19 is het pure DNA te zien zonder bandje, dit kan betekenen dat het ergens tijdens door verdunnen mogelijk fout is gegaan.

Laantjes 1 t/m 5 hadden bandjes moeten laten zien tussen de 800 en 1000 baseparen groot, maar er zijn geen bandjes te zien.

Laantjes 9 t/m 13 waren negatieve controles om te zien of er geen DNA bij de primers, buffer of MilliQ zat. Er zijn in deze laantjes ook geen bandjes te zien.

Laantje 17 heeft een product waarvan niet duidelijk was wat er hier gezien had moeten worden, dus is hier verder helaas niks over te zeggen.

Conclusie

Het doel van deze experimenten was om te bepalen of de Daphnia Pulex genen heeft die adrenerge receptoren tot expressie brengen. Dit werd gedaan aan de hand van DNA-isolatie waarop een PCR is uitgevoerd waarvan de resultaten visueel zijn weergegeven op een gel.

Als er gekeken wordt naar de uitkomst van de Nanodrop na het isoleren van het DNA, kan geconcludeerd worden dat het DNA niet zuiver is; er is namelijk een 260/280 ratio van 1,44. Als het DNA goed gezuiverd zou zijn, zou de ratio tussen de 1,8 en 2,2 hebben gelegen. Een ratio van 1,44 ligt hieronder, waardoor gesteld kan worden dat er DNA-contaminatie is opgetreden en er waarschijnlijk eiwitten in de DNA-oplossing aanwezig zijn. Verder ligt de concentratie van de oplossing op 13,5 ng/µl, wat relatief laag is.

Er is niet met duidelijkheid te zeggen dat de PCR goed is gegaan. Er zijn geen banden te zien op de gel van de verschillende primers + DNA, dus kan er verder niks gezegd worden over de PCR-producten. Mogelijk kan het zijn dat de fragmenten te klein waren, maar dit is onwaarschijnlijk, omdat de primers wel aangekleurd waren op de gel en deze de kleinste fragmenten zijn. De gelelektroforese is echter wel goed verlopen. Dit is te zien aan zowel de eiwitmarkers als de grote banden onder in de gel. De markers zien er goed uit en zijn duidelijk af te lezen. De dikke banden aan de onderkant van de gel zijn dus de primers, wat erop wijst dat de gelelektroforese goed is gegaan.

Discussie

Zoals er is voortgekomen uit de resultaten zijn, is het ergens in de protocollen niet goed gegaan. Om mogelijke verbeteringen van het protocol op te stellen, is er gekeken naar verschillende literaire bronnen van voorgaand uitgevoerde experimenten. Vanuit deze literatuur zijn er verschillende mogelijke aanpassing opgesteld:

Een mogelijke reden voor de extreem lage DNA-opbrengst kan het DNA-isolatie protocol zijn geweest. Wanneer het protocol vergeleken wordt met voorgaande uitgevoerde experimenten van anderen, zijn er verschillende stappen te zien die wij niet gedaan hebben. Zo worden de dieren voorafgaand vaak vrij gemaakt van microben a.d.h.v. antibiotica en worden de dieren gedehydrateerd en met vloeibaar stikstof ingevroren. Deze aanpassingen zouden voor een experiment op onze schaal niet reëel zijn. Een aanpassingen die wel mogelijk zou zijn voor studenten zouden langere wachtstappen zijn na het toevoegen van de Proteinase K en Buffer AL. Een laatste aanpassing die ook nog reëel zou zijn, zou het toevoegen van koude isopropanol zijn om ervoor te zorgen dat het DNA neerslaat en het supernatant met verontreiniging af gepipetteerd kan worden. (Angst, 2024)

Na het bekijken van de resultaten en het lezen van de conclusie is te zien dat het runnen van de gel goed is verlopen. De primers zijn duidelijk zichtbaar en de dikke banden onderaan de gel laten zien dat de primers goed en volledig door de gel zijn gegaan. Voor zover nu duidelijk is, hoeven hier dus geen aanpassingen aan gedaan te worden.

Het protocol leek grotendeels te werken. Wel was de annealingtemperatuur niet optimaal. De berekende annealingtemperatuur was 47 °C, terwijl de PCR-machine ingesteld stond op 51 °C. Waarschijnlijk heeft dit niet veel verschil gemaakt, maar het zou mogelijk wel een factor zijn geweest die enige invloed heeft gehad op de uitkomst. Dit had er namelijk voor kunnen zorgen dat de primers niet optimaal hebben kunnen binden, waardoor de elongatiestap ook niet goed is uitgevoerd. Als dit experiment herhaald zou worden, zou het verstandig zijn om de annealingstap daadwerkelijk op 47 °C uit te voeren.

Bijlagen

[Deze link leidt naar het pipetteerschema,indeling van onze gel en de berekende primer temperaturen]https://hogeschoolutrecht-my.sharepoint.com/:x:/r/personal/filou_lacroix_student_hu_nl/Documents/Cardiovasculaire%20ziekten%20-%20VL1212a/Protocollen/Pipetteerschema%20protocol%204.xlsx?d=w483338711454457b94ecf135650b76b6&csf=1&web=1&e=SMJFDi

Bronnen

Angst, P. (2024, 23 april). DNA-extraction of Daphnia and symbionts. protocols.io. https://www.protocols.io/view/dna-extraction-of-daphnia-and-symbionts-5jyl82n96l2w/v1