library(RcmdrMisc)
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RESUMEN

Debido a la capacidad de transformar la energia luminica en quimica y a la resiliencia a la hora de controlar el nivel osmotico y turgencia de diferentes aguas (rios, mares, lagos), se intereso en comprender el efecto de la intensidad luminica y la salinidad sobre el crecimiento en la circunferencia de las celulas de Neochloris cohaerens. Se llevo a cabo un experimento en condiciones de laboratorio utilizando cuatro tratamientos con diferente concentracion de sal e intensidad luminica, y se midio la circunferencia de sus celulas con un microscopio digital. Se observo un decrecimiento microalgal en los tratamientos de alta intensidad luminica mientras la concentracion de sal no provoco efecto alguno en el crecimiento de la microalga. Esto debido a la alta capacidad de disolucion y adaptabilidad de las algas, y a la accion fotosintetica que poseen. Ademas se determino que el tiempo de exposicion de luz, afecta de manera significativa el tamano de la microalga.

INTRODUCCION

Las microalgas son organismos unicelulares, eucariotas fotosinteticos que tienen la capacidad de transformar la energia luminosa en energia quimica. El crecimiento de estas especies radica en la utilizacion de luz como energia y CO2 como fuente de carbono. Estas caracteristicas les permiten tomar un rol importante ya que toman un papel como productores primarios de la red trofica, capaces de generar biomasa organica a partir del CO2 y la luz. (Abalde, 2004). Presentan altos niveles de produccion y adaptabilidad a las diferentes condiciones ambientales, por lo que se pueden encontrar en cualquier medio acuatico donde exista una fuente de carbono, nutriente, salinidad y luz suficiente (Molina, 2007). Ademas son de suma importancia ya que el uso de estas contribuyen de manera significativa a la produccion de biodiesel , ademas de la produccion de subproductos a partir de biomasa. El crecimiento de este microorganismo se ve alterado por las condiciones del entorno en que estos se encuentren, tales como temperatura, salinidad, luz, pH y nutrientes son factores que tienden a influenciar en ellas si no se encuentran en condiciones optimas (Elvira Antonio et al, 2010).

La salinidad es un factor muy importante en el crecimiento ya que este va afectar de diferentes maneras si se encuentra en bajas o altas concentraciones en el medio, una baja concentracion de salinidad o ausencia de esta puede provocar un aumento en el tamano de la celula, de lo contrario la presencia de una concentracion significativa de salinidad provoca una reduccion o inhibicion del tamano celular esto como respuesta al estres en el que se estan sometiendo y a la incapacidad de resistir a estas condiciones, ya que no pueden regular sus cambios osmoticos bajo estas alteraciones (Molina,2007). Otro factor importante en el crecimiento de estas celulas es la penetracion de la luz, la cual juega un papel importante debido a que es el suministro de la energia que necesita la celula para reproducirse, a diferentes intensidades de luz va a presentar menor o mayor cantidad en la tasa fotosintetica que realice la celula para su division y crecimiento celular. (Hernandez, G et al, 2009).

El genero de esta especie ha sido de gran importancia en la actualidad ya que se relaciona a la obtencion de biodiesel, debido a su capacidad para almacenar elevadas cantidades de lipidos que pueden ser transesterificados en la produccion de aceite, bioetanol y biogas (Garcia, 2015). Este estudio se centrara en determinar si la concentracion de sal y la intensidad luminica tienen interaccion en el crecimiento y tamano celular en Neochloris cohaerens.

METODOLOGIA

El trabajo se realizo en el laboratorio de microalgas de la Escuela de Ciencias Biologicas de la Universidad Nacional de Costa Rica. Se trabajo con Neochloris cohaerens a cuatro tratamientos diferentes; el primero fue el “Control”, el cual estaba formado por una concentracion de sal del medio de cultivo de 2.5 mg/L y luz normal con una intensidad de 42 micromolm-2s-1, el segundo tratamiento poseia 0.025% mas de sal y misma intensidad luminica, el tercero poseia sal normal y 95.33 micromolm-2s-1 y concentracion de sal igual al control, por ultimo, el cuarto tratamiento estaba compuesto por una concentracion salina 0,025% superior a la normal y 95.33 micromolm-2s-1 de luz.

Los tratamientos se inocularon cuando las algas estaban en su fase estacionaria del crecimiento, se tomaron dos muestras de cada tratamiento 30 minutos despues de haber inoculado los tratamientos. Se tomo 300 microL para cada muestra y se procedio a montar las laminas para verlas al microscopio y hacer las respectivas mediciones de circunferencia de cada celula.

Se midio la circunferencia mediante un microscopio digital que contaba con las herramientas necesarias, se midio 30 celulas de cada muestra, un total de 60 por tratamiento. Una semana despues de haber inoculado los tratamientos se repitio el procedimiento anterior. Luego los datos fueron analizados por el software Rstudio y se aplico la prueba de ANOVA (los significados de las combinaciones Letra-Numero son: S1=sal normal, S2=mas sal, L1=luz normal, L2=mas luz).

RESULTADOS

Para las algas al inicio de los tratamientos, la salinidad normal(x=33.96 ,sd=8.64) y la mas concentrada(x=35.78 ,sd=7.82) no afecto el diametro de N. cohaerens (F=3.438; g.l.=1,236; p>0.05) a un 95% de confianza, ademas se mostro que entre la luminosidad normal(x=37.64, sd=8.09) y la mayor (x=32.09, sd=7.52) si hubo una perdida significativa en el tamano a un 95% de confianza (F=32.191; g.l.=1,236; p<0.05). Se demostro que ambos factores tuvieron una interaccion significativa al 95% de confianza con respecto al crecimiento algal (F=13.524; g.l.=1,236; p<0.05).

Para la comparacion de medias al finalizar los tratamientos se encontro que no hay efecto importante de la salinidad entre los tratamientos(normal(x=39.16, sd=10.03), mayor(x=39.56 , sd=8.88)) en el alga N. cohaerens (F=0.109; gl=1,236; p>0.05). Por otro lado la relacion de la luminosidad normal(x=40.62, sd=9.86) y la mayor (x=38.09, sd=8.89 ) con el crecimiento algal tuvo una disminucion significativa (F =4.347; gl=1,236; p<0.05). En cuanto a la salinidad y la luminosidad, no hubo una interaccion existente con el crecimiento del alga (F=1.958; gl=1,236; p>0.05) a un 95% de confianza.

Finalmente en el analisis de varianza para observar los efectos de la luz y el tiempo con el crecimiento algal, se observo que el tiempo inicial(x=37.01 ,sd=24.3) no fue diferente al tiempo final(x=39.36, sd=9.45), por ende no tuvo significancia con el crecimiento celular(F=1.960; gl=1,476; p>0.05). Mientras que la influencia de la luz normal(x=40.19 ,sd=18.20) y mucha luz(x=36.18 ,sd=18.53665) sobre el crecimiento de dicha especie, fue significativamente menor (F=5.756; g.l.=1,476;p<0.05). No hubo interaccion entre el tiempo y la luz con una confiabilidad del 95%(F=1.793;gl=1,476; p>0.05).

ANOVA 1. Tratamiento inicial

inicio <- read.table(file="C:/Users/verov/Documents/Pubs/Microalgas/Inicio.txt", header=TRUE, sep="")
attach(inicio) #Adjuntar conjunto de datos iniciales
anova1<-aov(Circunferencia~Salinidad*Luminosidad, data = inicio) #Aplicamos la anova para los datos iniciales
summary(anova1) #Nos brinda el resumen de la anova para los datos iniciales en donde la H0: La salinidad y luminosidad llevan a una igualdad entre las medias de la circunferencia. H1: Hay diferencia entre las medias debido a la sal y la luz.
##                        Df Sum Sq Mean Sq F value   Pr(>F)    
## Salinidad               1    200   199.9   3.482 0.063289 .  
## Luminosidad             1   1847  1847.4  32.185 4.09e-08 ***
## Salinidad:Luminosidad   1    776   776.2  13.522 0.000292 ***
## Residuals             236  13547    57.4                     
## ---
## Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
TukeyHSD(anova1)
##   Tukey multiple comparisons of means
##     95% family-wise confidence level
## 
## Fit: aov(formula = Circunferencia ~ Salinidad * Luminosidad, data = inicio)
## 
## $Salinidad
##           diff        lwr      upr     p adj
## S2-S1 1.825083 -0.1018397 3.752006 0.0632893
## 
## $Luminosidad
##            diff      lwr       upr p adj
## L2-L1 -5.548917 -7.47584 -3.621994     0
## 
## $`Salinidad:Luminosidad`
##                  diff        lwr        upr     p adj
## S2:L1-S1:L1 -1.771667  -5.350709  1.8073759 0.5760623
## S1:L2-S1:L1 -9.145667 -12.724709 -5.5666241 0.0000000
## S2:L2-S1:L1 -3.723833  -7.302876 -0.1447907 0.0378908
## S1:L2-S2:L1 -7.374000 -10.953043 -3.7949574 0.0000014
## S2:L2-S2:L1 -1.952167  -5.531209  1.6268759 0.4935341
## S2:L2-S1:L2  5.421833   1.842791  9.0008759 0.0006682
plot(TukeyHSD(anova1))

plot(anova1)

tapply(Circunferencia,Salinidad, mean)  #calcular medias de los factores
##       S1       S2 
## 33.95950 35.78458
tapply(Circunferencia,Luminosidad, mean)
##       L1       L2 
## 37.64650 32.09758
tapply(Circunferencia,Salinidad, sd) #calcular desviacion estandar de los factores
##       S1       S2 
## 8.643137 7.821788
tapply(Circunferencia,Luminosidad, sd)
##       L1       L2 
## 8.092016 7.520526
boxplot(Circunferencia ~ Salinidad*Luminosidad, data=inicio, col="16", 
  xlab="Sal y Luz", ylab="Tamano")#grafica de cajas para comparar medias

interaction.plot(Salinidad,Luminosidad,  Circunferencia, 
  main="Interaction Plot") #para comparar la interaccion de las variables

with(inicio, plotMeans(Circunferencia, Luminosidad, Salinidad, 
  error.bars="se")) #Grafica para comparar las medias

ANOVA 2. Tratamiento final

final <- read.table(file="C:/Users/verov/Documents/Pubs/Microalgas/Final.txt", header=TRUE, sep="")
attach(final) #Adjuntar conjunto de datos finales
anova2<-aov(Circunferencia2~Salinidad2*Luminosidad2,data = final) #Aplicamos la anova para los datos finales
summary(anova2) #Nos brinda el resumen de la anova para los datos finales
##                          Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)  
## Salinidad2                1     10     9.6   0.109 0.7414  
## Luminosidad2              1    383   383.4   4.347 0.0382 *
## Salinidad2:Luminosidad2   1    173   172.6   1.957 0.1631  
## Residuals               236  20816    88.2                 
## ---
## Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
TukeyHSD(anova2)
##   Tukey multiple comparisons of means
##     95% family-wise confidence level
## 
## Fit: aov(formula = Circunferencia2 ~ Salinidad2 * Luminosidad2, data = final)
## 
## $Salinidad2
##            diff       lwr      upr     p adj
## S2-S1 0.4005833 -1.988058 2.789225 0.7414007
## 
## $Luminosidad2
##            diff       lwr        upr     p adj
## L2-L1 -2.527917 -4.916558 -0.1392749 0.0381504
## 
## $`Salinidad2:Luminosidad2`
##                   diff       lwr       upr     p adj
## S2:L1-S1:L1 -1.2956667 -5.732300 3.1409665 0.8741873
## S1:L2-S1:L1 -4.2241667 -8.660800 0.2124665 0.0684143
## S2:L2-S1:L1 -2.1273333 -6.563966 2.3092998 0.6016395
## S1:L2-S2:L1 -2.9285000 -7.365133 1.5081332 0.3218448
## S2:L2-S2:L1 -0.8316667 -5.268300 3.6049665 0.9623674
## S2:L2-S1:L2  2.0968333 -2.339800 6.5334665 0.6129488
plot(TukeyHSD(anova2))

plot(anova2)

tapply(Circunferencia2,Salinidad2, mean)  #calcular medias de los factores
##       S1       S2 
## 39.16158 39.56217
tapply(Circunferencia2,Luminosidad2, mean)
##       L1       L2 
## 40.62583 38.09792
tapply(Circunferencia2,Salinidad2, sd)  #calcular desviacion estandar de los factores
##        S1        S2 
## 10.035895  8.881463
tapply(Circunferencia2,Luminosidad2, sd)
##       L1       L2 
## 9.864764 8.896341
boxplot(Circunferencia2 ~ Salinidad2*Luminosidad2, data=final, col="16", 
  xlab="Sal y Luz", ylab="Tamano")#grafica de cajas para comparar medias

interaction.plot(Salinidad2,Luminosidad2,  Circunferencia2, 
  main="Interaction Plot") #para comparar la interaccion de

ANOVA 3. Comparacion Inicial vs Final

tiempo <- read.table(file="C:/Users/verov/Documents/Pubs/Microalgas/Tiempo.txt", header=TRUE, sep="")
attach(tiempo) #Adjuntar conjunto de datos
anova3<-aov(Circun~Tiempo*Luz, data = 
  tiempo)# Aplicamos la anova para observar la interaccion de la luz y el tiempo con respecto al tamano
summary(anova3)# Nos brinda el resumen de la anova
##              Df Sum Sq Mean Sq F value   Pr(>F)    
## Tiempo        1   2419  2419.0  32.416 2.18e-08 ***
## Luz           1   1957  1957.1  26.225 4.42e-07 ***
## Tiempo:Luz    1    274   273.8   3.669    0.056 .  
## Residuals   476  35521    74.6                     
## ---
## Signif. codes:  0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1
TukeyHSD(anova3)
##   Tukey multiple comparisons of means
##     95% family-wise confidence level
## 
## Fit: aov(formula = Circun ~ Tiempo * Luz, data = tiempo)
## 
## $Tiempo
##                    diff       lwr       upr p adj
## inicial-final -4.489833 -6.039376 -2.940291     0
## 
## $Luz
##            diff       lwr       upr p adj
## L2-L1 -4.038417 -5.587959 -2.488874 4e-07
## 
## $`Tiempo:Luz`
##                             diff        lwr        upr     p adj
## inicial:L1-final:L1   -2.9793333  -5.854542 -0.1041247 0.0389480
## final:L2-final:L1     -2.5279167  -5.403125  0.3472920 0.1073600
## inicial:L2-final:L1   -8.5282500 -11.403459 -5.6530413 0.0000000
## final:L2-inicial:L1    0.4514167  -2.423792  3.3266253 0.9775633
## inicial:L2-inicial:L1 -5.5489167  -8.424125 -2.6737080 0.0000054
## inicial:L2-final:L2   -6.0003333  -8.875542 -3.1251247 0.0000007
plot(TukeyHSD(anova3))

plot(anova3)

tapply(Circun,Tiempo, mean)  #calcular medias de los factores
##    final  inicial 
## 39.36187 34.87204
tapply(Circun,Luz, mean)
##       L1       L2 
## 39.13617 35.09775
tapply(Circun,Tiempo, sd)  #calcular desviacion estandar de los factores
##    final  inicial 
## 9.458559 8.276112
tapply(Circun,Luz, sd)
##       L1       L2 
## 9.126060 8.752506
boxplot(Circun ~ Tiempo*Luz, data=tiempo, col="16", xlab="Tiempo", 
  ylab="Tamano")#grafica de cajas para comparar medias

interaction.plot(Tiempo,Luz,  Circun, main="Interaction Plot") #para comparar la interaccion de las variables

with(tiempo, plotMeans(Circun, Luz, Tiempo, error.bars="se")) #grafica para comparar las medias

DISCUSION

La significancia del efecto de la luminosidad en la circunferencia de N. cohaerens al realizar un analisis de varianzas para los datos apenas se inocularon los tratamientos, provoco una disminucion de la misma a una mayor intensidad luminica; por el contrario, las diferentes concentraciones de sal a las cuales estuvo expuesta esta microalga no tuvieron efecto significativo (p>0.05), esto se debe a que las microalgas tienen un rango de tolerancia muy alto a la concentracion de sales, lo cual no implica que crezcan bien a las diferentes salinidades (Brown y col., 1996). Ademas se observo que la cantidad de sal y la intensidad luminica poseen una interaccion significativa al relacionarse con la circunferencia incluso a mas del 99.9%. El cambio en la circunferencia de las algas al inicio del experimento se pudo ver afectado ya que los datos se recolectaron 30 minutos despues de haberlas inoculado. La prueba de ANOVA para los datos finales dio como resultado que la luminosidad posee un efecto significativo al 99% en la circunferencia del alga en estudio. La salinidad no genero ningun efecto en su crecimiento (P>0.05). Se logro observar que a mayor intensidad de luz, las celulas de esta microalga disminuyen su tamano.

La falta de efecto de la salinidad sobre el crecimiento de N. cohaerens coincide con los resultados obtenidos de la microalga Isochrysis galbana (Luz Adriana Velasco, 2009), esto debido a que los valores extremos de salinidad afectan negativamente las tasas de fotosintesis, respiracion y crecimiento de las microalgas marinas (Lobban et al., 1985, Marin et al., 1998; Bermudez et al., 2002; Helm et al., 2006). En este experimento se observo una disminucion en el tamano de las celulas del alga ya que la exposicion a medios con bajas salinidades ocasiona el hinchamiento de las celulas e incluso su explosion, los medios hipertonicos producen la deshidratacion de las mismas (Lobban et al., 1985).

La disminucion de tamano de N. cohaerens debido a una mayor intensidad luminica contradice los resultados obtenidos en microalgas como Isochrysis sp. (Luz Adriana Velasco, 2009), Chaetoceros sp. (Sanchez-Saavedra y Voltolina, 1994); Chroomonas sp. (Bermudez et al., 2002) y Tetraselmis suecica (Helm et al., 2006), en las cuales se dio un aumento de tamano al estar expuestas a mayor intensidad de luz. Esta disminucion en el tamano puede ocurrir ya que a intensidades muy altas de luz la produccion fotosintetica sufre un retardo y una disminucion debido a un efecto de inhibicion en la produccion y fotooxidacion de los pigmentos (Fogg, 1965; Sanchez-Saavedra y Voltolina, 1994)

Se realizo un tercer analisis comparativo entre el tiempo, sean inicio y final, con la luminosidad recibida. Los resultados exponen que el tiempo de exposicion afecto de manera significativa el tamano de las microalgas (p<0.05), al igual que la intensidad luminosa influencia su circunferencia. Ademas a la hora de analizar ambos factores juntos, se puede determinar que no muestra efecto significativo (p<0.05) en la circunferencia de N. cohaerens, es decir que el tamano al inicio y el tamano al final comparados entre si, no muestran un cambio significativo; con lo que se puede concluir que la luz y el tiempo juntos tiene el mismo efecto sobre la circunferencia.

Una baja concentracion de salinidad o ausencia de esta, puede provocar un aumento en el tamano de la celula, de lo contrario la presencia de una concentracion significativa de salinidad provoca una reduccion o inhibicion del tamano celular esto como respuesta al estres en el que se estan sometiendo y a la incapacidad de resistir a estas condiciones, ya que no pueden regular sus cambios osmoticos bajo estas alteraciones.

CONCLUSIONES

1- A partir de los analisis estadisticos realizados para los datos obtenidos al inicio del experimento, se concluye que la exposicion de N. cohaerens a diferentes concentraciones de sal no provoca ningun efecto en su crecimiento, por el contrario, la incidencia de una mayor intensidad luminica causa un decrecimiento en sus celulas.

2-Tras realizar la prueba de ANOVA y de Tukey en los datos finales, se puede concluir que la salinidad no es un factor que afecte el crecimiento del alga en estudio, sin embargo la luz si genera un efecto en N. cohaerens disminuyendo la circunferencia de sus celulas.

3- La intensidad luminica y el tiempo de exposicion poseen influencia sobre el alga de tal manera que genera cambios significativos en su crecimiento. Es posible concluir que al haber un aumento en la intensidad de luz y el tiempo de exposicion, va a haber un decrecimiento en el tamano de N. cohaerens.

REFERENCIAS