Objets de l’analyse

Le projet cosiste à analyser de la diversité de Diplocarpon rosae (agant pathogènes responsables de ma ladies des taches noires chez le rosier). De plus amples détails sont décrits dans le document stocké ici

smb://pnas1.stockage.inrae.fr/angersnantes-irhs/irhs/irhs-GDO/02-Determinisme/02-Maladies_foliaires/11-MARRS/Discussions_collaborations_EcoFun/Mode opératoire pour le prélèvement de taches noires pour analyse de la diversité.docx

Choix d’une méthode d’isolation de l’ADN du champignon

Expérimentation 1

Méthode d ’analyse Ind ividus OW anal ysés FW ( mg) AN (µg) Nan odrop A260 /A280 A26 0/A230

AN ( µg)

Qu bit
Nucleospin Food OW 9022 14 11,4 2,1 1,8 1,7
Nucleospin Food OW 9125 22 2 2 2,7
Nucleospin Food OW 9142 13,7 2 1,8 2,3
Nucleospin Food OW 9169 16,6 1,9 2,5 2,1
Nucleospin Food OW 9185 11,7 2,3 14 2,2
Nucleospin Plant II OW 9005 14 14,6 2,2 6 2,1
Nucleospin Plant II OW 9073 5,6 2,2 2,6 0,7
Nucleospin Plant II OW 9192 11,5 2,2 2,3 1,1
SILEX OW 9001 14 1,8 1,2 1,2
SILEX OW 9018 14 12 1,8 1,2 1,8
SILEX OW 9077 8 1,8 1,2 1,6

Nucleospin Food : Déroulé selon le guide du kit (ajout de proteinase K issue d’un kit NEB (celle du kit n’a pas été conservé à -20°c) et de DNAse au lieu de RNAse, incubation à 65°C durant 1h ; élution avec 100µL passé deux fois sur la colonne)

Je refais un essai sur deux echantillons

Nucleospin Plant II : Déroulé selon le guide du kit (incubation à 65°C durant 1h ; élution avec 100µL passé deux fois sur la colonne)

SILEX : déroulé selon le mode opératoire décrit dans l’article Vilanova et al., 2020

90µL d’eluat

Contrôles qualité :

Dépôt sur gel agarose 1% TAE0,5X 125 volts 25minutes déposer 4µL de solution

A faire : Amplification PCR

A discuter avec Sophie

Matériel :

  • Les 11 ADNg extraits lors de la phase de test.

  • ADNg controle : RxW et RcOB, et souches de Diplocarpon rosae

  • Les amorces SSR Diplocarpon possibles

  • set de cinq paires d’amorces angevines (Projet Rosa fortissima)/Volumes/irhs/irhs-GDO/02-Determinisme/02-Maladies_foliaires/11-MARRS/Discussions_collaborations_EcoFun/Donnees_diplo_Marolleau

empla cement
  • *Name**
 Primer sequence (5'-3') R epeat mo tif Ta (° C) N~a ~ S ize ra nge (bp )

15.003

 DRa ngTC-2F CCATCCC ATCTCACTTCTTCATCTC (TC )29 5 4,77 2 38 4 - 458

15.004

 DRa ngTC-2R GC TATTGACTGCCGCCATCT 5 4,74

15.011

 DRa ngAG-6F CAAAAA TGCTGGAAAAGTGGCTGG (G A)9 5 5,93 3 15 2 - 158

15.012

 DRa ngAG-6R CAGCC TAGCAACAACTCTGTTGT 5 3,25

15.035

 DRan gTC-18F CCGCAA AAGATATCCGATGACCCG ( TC)~2 ~G(TC )15 5 8,05 4 27 3 - 299

15.036

 DRan gTC-18R TGCTT TTTGGGGTACTGACGGGC 5 9,63

15.019

 DRan gCA-10F CT TCGCAGCGGCTTTCGTGG (A C)9 5 9,25 2 28 5 - 291

15.020

 DRan gCA-10R AC CGAAGCCCCGAGTCTGCT 59,9

15.023

 DRan gGA-12F ACATCAA CACTGGCTCAGACCAAGC (G A)4 5 9,44 4 18 8 - 262

15.024

 DRan gGA-12R R : CTCCT GGTCCGTCCGTATCTCTC 5 7,56
  • Un set de paire d’amorces issus de la publication (Münnekhoff et al., 2017)

empla cement

 Primer name Primer sequence (5′–3′) Motif A nnea ling t emp. (°C) N~a ~ Le ng th (b p)
MDR 30F CG TGAGGGTTTTCGGGGATTG (G AA)12 impe rfect 58 6 1 85
MDR 30R GA AGGCGGCTTTCGGCTTTTC 58
MDR 33F TGACTGGGCGCTCTTCC (AAA C)5,3 56 2 2 63
MDR 33R CT ACTGCCAAGTCACCACTCG 56
MDR 102F A TTGGGACAGGTAGCGGAAT ( GTT)7 impe rfect 55 1 1 95
MDR 102R G AGAGGATCGTATCGGCATC 55
MDR 104F G GGCTTGAGAGCCAATCTAC Aty pical stru cture 55 2 1 85
MDR 104R A CAAAACAACCAGCGCTCTC 55
MDR 112F C GGGATGAGAGAATCGTGTT (CT T)8,7 57 3 5 34
MDR 112F C TTGTCGACAGCAAGATGGA 57
MDR 113F C GATCGAAGTTCTCGTGGAT ( GAT)8 55.5 2 5 27
MDR 113R G ATGGAAGGAGCCATCTGAG 55.5 5 27

Normaliser la concentration des solutions d’ADNg

Utiliser un microlitre de cette solution mère (20ng/µL)

Chez Munnekhof, il indique utiliser 10ng de solution d’ADNg isolée depuis des cultures monosporées.

Chez nous, les cultures ne sont pas pures ni même isolées du support foliaire. Il est necessaire d’utiliser une meme quantité voire une quantité supérieure si possible.

Essai d’amplification du couple de primers DRangTC2. (10/10/2021)

Evaluation de la Tm : gradient de température (51°C/61°C)

Matériel : ADNg OW9018 extrait par méthode Vilanova

Primers DRangTC2 : solution 10µM

ADNg Difra67 (5ng/µL)

Méthodes:

  1. Dilution de l’ADNg OW9018.

Cette solution est estimée à 18ng/µL au Qubit.

Je la dilue au ½ pour obtenir une solution à 9ng/µL

  1. Amplification par GoTaq Flexi G2 Promega
1X 10X
Tampon 5X 3 µL 30
MgCl2 25 mM 0.9 µL 9
dNTP 2.5 mM 0.5 µL 5
Amorce F 166pM 0.25 µL 2,5
Amorce R 166pM 0.25 µL 2,5
Gotaq 0.07 µL 0,7
H2O Qsp 15 µL 100

Prélevement de 2X 13µL de solution qui servent à

-contrôle positif : ajout de 2µL de solution ADNg Difra67 (5ng/µL)

-contrôle négatif : ajout de 2µL d’H2O

1µL de solution d’ADNg OW9018 à 9ng/µL (soit 10ng) sont ajoutés au mix restant (124µL)

Je prélève ensuite 15µL que je dispatche dans six tubes (un par température)

Programme : Juju avec 39 cycles

Résultats :

Le contrôle négatif est OK.

Le contrôle positif est OK avec taille attendue

La tempréature optimale est 55°C.

Beaucoup de dimers de primers.

Diluer plus les primers et amplifier moins longtemps

Amplification du couple de primers DRangTC2. (10/10/2021)

Evaluation de la qualité des ADNg extraits par les trois méthodes.

Matériel :

11ADNg OW extraits

Primers DRangTC2 : solution 10µM

ADNg Difra67 (5ng/µL)

Méthodes:

  1. Dilution des solutions d’ADNg

Les solutions sont diluées de manière à obtenir des solutions concentrées à 10ng/µL.

Réalisation sur la base du dosage fluo Qubit

Méthode d’analyse Individus OW analysés (AN) (ng/µL) Qubit Facteur de dilution appliqué
1 Nucleospin Food  OW 9022 17 2
2 Nucleospin Food  OW 9125 27 2
3 Nucleospin Food  OW 9142 23 2
4 Nucleospin Food  OW 9169 21 2
5 Nucleospin Food  OW 9185 22 2
6 Nucleospin Plant II OW 9005 21 2
7 Nucleospin Plant II OW 9073 7 1
8 Nucleospin Plant II OW 9192 11 1
9 SILEX OW 9001 12 1
10 SILEX OW 9018 18 2
11 SILEX OW 9077 16 2
  1. Amplification par GoTaq Flexi G2 Promega

Suite à l’experimentation gradient de température, la concentration des amorces est réduite.(166pM à 133pM) ainsi que le nombre de cycles d’amplification

Mélange réactionnel :

1X 15X
Tampon 5X 3 µL 45
MgCl2 25 mM 0.9 µL 13,5
dNTP 2.5 mM 0.5 µL 7,5
Amorce F 133pM 0.2 µL 3,5
Amorce R 133pM 0.2 µL 3,75
Gotaq 0.07 µL 1
H2O Qsp 15 µL 150

Prélevement de 2X 13µL de solution qui servent à

-contrôle positif : ajout de 2µL de solution ADNg Difra67 (5ng/µL) DRAngTC2

-contrôle positif : ajout de 2µL de solution ADNg OB (5ng/µL) UBC

-contrôle négatif : ajout de 2µL d’H2O

1µL de solution d’ADNg OW9018 à 9ng/µL (soit 10ng) sont ajoutés au mix restant (124µL)

Je prélève ensuite 15µL que je dispatche dans six tubes (un par température)

Programme : Juju avec 35 cycles

Bilan :

Le contrôle positif DiFra67 fonctionne comme attendu tout comme deux des trois contrôles négatif (OB, H2O).

Un très faible signal semble apparaitre dans Rw

Deux des cinq solutions extraites avec le kit Nucleospin Food montrent une amplification contrastée. OW 9022, OW9142.

L’extraction de OW 9169 et OW 9185 a été réalisée en seconde intention et selon une procédure altérée. NE PAS PRENDRE en COMPTE.

Deux des trois solutions extraites avec le kit Nucleospin Plant montrent une amplification forte et peu contrastée. OW 9005, OW 9073

Aucune des trois solutions extraites avec le protocole SILEX ne montre d’amplification visible.

Ce dernier résultat est étonnant car la vérification de la Tm a été réalisé sur l’ADNg de OW 9018, extrait par SILEX (Cf p.285)

Le signal n’était cependant pas fort.

La concentration et le nombre d’amplification ont été réduits tandis que j’ai amplifié sur une nouvelle dilution.

Ca fait beaucoup de changement en meme temps.

D’autant qu’il ne faut pas négliger l’aspect quantitatif.

La(les) souche(s) amplifiant cette répétition ne sont peut-etre pas nombreuses dans ce symptomes

Je refais une expérimentation uniquement sur la solution OW9018

Matériel :

Solutions d’ADNg :

  • DiFra67(5ng/µL)

  • OW9018 (18ng/µL)

Méthode :

  • Dilution au 1/10 et au 1/100 de la solution d’ADNg OW9018

  • Amplification par GoTaq Flexi G2 Promega

J’adopte les paramètres d’amplification initiaux ; amorces à 166pM, et nombre de cycles à 40.

Deux mélanges d’amplification sont réalisés :

-DRangTC2

-UBC en guise d’amplification contrôle (amplifie l’ADNg de rosier)

Bilan :

Pas d’amplification pour UBC. Je peux refaire une dilution des amorces 100µM ou bien utiliser un autre couple d’amorces en guise de contrôle.

Pour DRAngTC2 :

Contrôle + et - : OK

Pas d’amplification quelque soit la dilution.

Le facteur de dilution devant etre réalisé était de 1/2

A envisager :

  • Revoir comment amplifier ce marqueur. Cf première manip sur gradient de température.

  • Voir la bibliographie : quantification souche un pop

  • Voir avec Mélanie Sannier

  • Voir pour les autres marqueurs.

empla cement
  • *Name**
 Primer sequence (5'-3') R epeat mo tif Ta (° C) N~a ~ S ize ra nge (bp )

15.003

 DRa ngTC-2F CCATCCC ATCTCACTTCTTCATCTC (TC )29 5 4,77 4 38 4 - 458

15.004

 DRa ngTC-2R GC TATTGACTGCCGCCATCT 5 4,74

15.011

 DRa ngAG-6F CAAAAA TGCTGGAAAAGTGGCTGG (G A)9 5 5,93 3 15 2 - 158

15.012

 DRa ngAG-6R CAGCC TAGCAACAACTCTGTTGT 5 3,25

15.035

 DRan gTC-18F CCGCAA AAGATATCCGATGACCCG ( TC)~2 ~G(TC )15 5 8,05 6 27 3 - 299

15.036

 DRan gTC-18R TGCTT TTTGGGGTACTGACGGGC 5 9,63

15.019

 DRan gCA-10F CT TCGCAGCGGCTTTCGTGG (A C)9 5 9,25 2 28 5 - 291

15.020

 DRan gCA-10R AC CGAAGCCCCGAGTCTGCT 59,9

15.023

 DRan gGA-12F ACATCAA CACTGGCTCAGACCAAGC (G A)4 5 9,44 5 18 8 - 262

15.024

 DRan gGA-12R R : CTCCT GGTCCGTCCGTATCTCTC 5 7,56

Pourront-ils être amplifiés en mélange?

Nop !

DRangTC2: ATTO565

DRangAG6: ATTO565

DRangTC18 : ATTO565

DRangCA10: ATTO565

DRangGA12: FAM

Expérimentation 2 sur la méthode d’extraction est-elle la plus adaptée

Matériel :

9 solutions diluées d’ADNg OW extraits (les deux extraits Nucleospin food #2 sont écartés)

Méthode d’analyse Individus OW analysés (AN) (ng/µL) Qubit Facteur de dilution appliqué
1 Nucleospin Food  OW 9022 17 2
2 Nucleospin Food  OW 9125 27 2
3 Nucleospin Food  OW 9142 23 2
6 Nucleospin Plant II OW 9005 21 2
7 Nucleospin Plant II OW 9073 7 1
8 Nucleospin Plant II OW 9192 11 1
9 SILEX OW 9001 12 1
10 SILEX OW 9018 18 2
11 SILEX OW 9077 16 2

Solutions ADNg OB et Rhw, et Difra67 (5ng/µL)

Cinq couples d’amorces DRang: solution 10µM

Le couple d’amorces KSN F100*R446 en guise de contrôle d’amplification

Méthode:

  1. Amplification par GoTaq Flexi G2 Promega

Suite à l’experimentation gradient de température, la concentration des amorces est réduite.(166pM à 133pM).

1X 15X
Tampon 5X 3 µL 45
MgCl2 25 mM 0.9 µL 13,5
dNTP 2.5 mM 0.5 µL 7,5
Amorce F 133pM 0.2 µL 3,5
Amorce R 133pM 0.2 µL 3,5
Gotaq 0.07 µL 1
H2O Qsp 15 µL 150

Dépôt de 13µL de mélange réactionnel

2µL de solution d’ADNg diluées (soit 10ng) sont ajoutés

-contrôle positif : ajout de 2µL de solution ADNg Difra67 (5ng/µL) DRAng

-contrôle positif : ajout de 2µL de solution ADNg OB (5ng/µL) KSN

-contrôle négatif : ajout de 2µL d’H2O

Programme : Juju avec 40 cycles

Résultats :

L : Benchtop100bp Ladder (Promega)

A : DRAng- TC2

B : DRAng-AG6

C : DRAng-CA10

D : DRAng-GA12

E : DRAng- TC18

F : KSN

Bilan :

Contrôle T+ et T- Echantillons positifs Précédents
A : DRAng- TC2 OK, taille attendue OW 9192, et OB à >1500bp

OW 9022, OW9142

OW 9005, OW 9073
B : DRAng-AG6 H2O OK, multibande pour Dr OB avec taille > 800bp -
C : DRAng-CA10 OK, taille attendue OW 9073, OW 9192 -
D : DRAng-GA12 OK, taille attendue OW 9022, OW 9073, OW 9192 -
E : DRAng- TC18 OK, taille attendue OW 9073, OW 9192 -
F : KSN

OK, taille attendue

Pas d’amplif pour RhW

 OW 9192 OW 9001 OB OB et Rw

Bilan :

Les solutions d’ADNg isolées avec le NucleoSpin Plant II permettent d’amplifier la plupart des marqueurs.

A faire :

Extraire les ADNg à partir des 120 échantillons restant.

Demande de devis à Macherey Nagel pour

740669 4450 NucleoSpin 8 Plant II (12x8)

Proposition téléphonique de M Leroy-50% = 166euros

blast des amorces sur génomeS RcOB-wordsize 7, -nodust,

Regroupement des données de RchiOB

:~/references/RcOB_Lyonnuc$ mv RchiOBHm-V2.genome.fasta ~/references/RcOB/RchiOBHm_V2_lyon.fasta

« RchiOBHm-V2.genome.fasta » -> « /mnt/home2/jjeauffre/references/RcOB/RchiOBHm_V2_lyon.fasta »

:~/references/RcOB_Lyonnuc$ cd ..

:~/references$ cd RcOB

:~/references/RcOB$ ls

RchiOBHm_V2_lyon.fasta RcOB_hap3_ang.fasta

:~/references/RcOB$ mv RcOB_hap3_ang.fasta RchiOBHm_V1_ang.fasta

« RcOB_hap3_ang.fasta » -> « RchiOBHm_V1_ang.fasta »

:~/references/RcOB$ ls

RchiOBHm_V1_ang.fasta RchiOBHm_V2_lyon.fasta

Création ds bases de données

:~/references/RcOB$ makeblastdb -in RchiOBHm_V2_lyon.fasta -out RchiOB_lyon -dbtype nucl

Building a new DB, current time: 11/22/2021 16:13:44

New DB name: RchiOB_lyon

New DB title: RchiOBHm_V2_lyon.fasta

Sequence type: Nucleotide

Keep Linkouts: T

Keep MBits: T

Maximum file size: 1000000000B

Adding sequences from FASTA; added 55 sequences in 18.1803 seconds.

:~/references/RcOB$ makeblastdb -in RchiOBHm_V1_ang.fasta -out RchiOB_ang -dbtype nucl

Building a new DB, current time: 11/22/2021 16:14:23

New DB name: RchiOB_ang

New DB title: RchiOBHm_V1_ang.fasta

Sequence type: Nucleotide

Keep Linkouts: T

Keep MBits: T

Maximum file size: 1000000000B

Adding sequences from FASTA; added 8 sequences in 16.6039 seconds.

Alignement sur bases de données

:~/references/RcOB$ nohup blastn -query ~/blasts/Didi_primers.fasta -db ~/references/RcOB/RchiOBHm_V1_ang.fasta -out ~/blasts/blastdidiprimersOBang.txt &

\[2\] 36876

:~/references/RcOB$ nohup: les entrées sont ignorées et la sortie est ajoutée à « nohup.out »

\[2\]+ Termine 2 nohup blastn -query ~/blasts/Didi_primers.fasta -db ~/references/RcOB/RchiOBHm_V1_ang.fasta -out ~/blasts/blastdidiprimersOBang.txt

:~/references/RcOB$ more nohup.out

BLAST Database error: No alias or index file found for nucleotide database \[/mnt/home2/jjeauffre/references/RcOB/RchiOBHm_V1_ang.fasta\] in search path \[/mnt/home2/jjeauffre/references/RcOB::\]

:~/references/RcOB$ ls

nohup.out RchiOB_ang.nhr RchiOB_ang.nin RchiOB_ang.nsq RchiOBHm_V1_ang.fasta RchiOBHm_V2_lyon.fasta RchiOB_lyon.nhr RchiOB_lyon.nin RchiOB_lyon.nsq

:~/references/RcOB$ nohup blastn -evalue 1000 -word_size 7 -dust no -query ~/blasts/Didi_primers.fasta -db ~/references/RcOB/RchiOBHm_V1_ang.fasta -out ~/blasts/blastdidiprimersOBang.txt &

\[2\] 36993

:~/references/RcOB$ nohup: les entrées sont ignorées et la sortie est ajoutée à « nohup.out »

\[2\]+ Termine 2 nohup blastn -evalue 1000 -word_size 7 -dust no -query ~/blasts/Didi_primers.fasta -db ~/references/RcOB/RchiOBHm_V1_ang.fasta -out ~/blasts/blastdidiprimersOBang.txt

:~/references/RcOB$ more nohup.out

BLAST Database error: No alias or index file found for nucleotide database \[/mnt/home2/jjeauffre/references/RcOB/RchiOBHm_V1_ang.fasta\] in search path \[/mnt/home2/jjeauffre/references/RcOB::\]

:~/references/RcOB$ ls

RchiOB_ang.nhr RchiOB_ang.nin RchiOB_ang.nsq RchiOBHm_V1_ang.fasta RchiOBHm_V2_lyon.fasta RchiOB_lyon.nhr RchiOB_lyon.nin RchiOB_lyon.nsq

##Essai sur autre db

:~/references/RcOB$ cd ~/references/RcOB_Angnuc/

:~/references/RcOB_Angnuc$ ls

numberAA.out OBDH_1.0_formated.fasta.nsi OBn_Chr00.fasta.nsq OBn_Chr02.fasta.nhr OBn_Chr03.fasta.nsq OBn_Chr05.fasta.nhr OBn_Chr06.fasta.nsq sequences_cds.fna

OBDH_1.0_formated.fasta OBDH_1.0_formated.fasta.nsq OBn_Chr00.xml OBn_Chr02.fasta.nin OBn_Chr03.xml OBn_Chr05.fasta.nin OBn_Chr06.xml sequences_cds.fna.nhr

OBDH_1.0_formated.fasta.nhr OBDH_1.0_gene_models.gff3 OBn_Chr01.fasta.nhr OBn_Chr02.fasta.nsq OBn_Chr04.fasta.nhr OBn_Chr05.fasta.nsq OBn_Chr07.fasta.nhr sequences_cds.fna.nin

OBDH_1.0_formated.fasta.nin OBDH_1.0_gene_models.gtf OBn_Chr01.fasta.nin OBn_Chr02.xml OBn_Chr04.fasta.nin OBn_Chr05.xml OBn_Chr07.fasta.nin sequences_cds.fna.nsq

OBDH_1.0_formated.fasta.nog OBn_Chr00.fasta.nhr OBn_Chr01.fasta.nsq OBn_Chr03.fasta.nhr OBn_Chr04.fasta.nsq OBn_Chr06.fasta.nhr OBn_Chr07.fasta.nsq sequences_prot_HapOB3.fasta.fai

OBDH_1.0_formated.fasta.nsd OBn_Chr00.fasta.nin OBn_Chr01.xml OBn_Chr03.fasta.nin OBn_Chr04.xml OBn_Chr06.fasta.nin OBn_Chr07.xml

:~/references/RcOB_Angnuc$ nohup blastn -query ~/blasts/Didi_primers.fasta -db ~/references/RcOB_Angnuc/OBDH_1.0_formated.fasta -out ~/blasts/blastdidiprimersOBang.txt &

\[2\] 39115

:~/references/RcOB_Angnuc$ nohup: les entrées sont ignorées et la sortie est ajoutée à « nohup.out »

\[2\]+ Termine 255 nohup blastn -query ~/blasts/Didi_primers.fasta -db ~/references/RcOB_Angnuc/OBDH_1.0_formated.fasta -out ~/blasts/blastdidiprimersOBang.txt

:~/references/RcOB_Angnuc$ more nohup.out

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Création ds bases de données

:~/references/Rhwichurana$ ls

haplotype1.fasta haplotype2.fasta unplaced.fasta

:~/references/Rhwichurana$ makeblastdb -in haplotype1.fasta -out RhW_haplo1 -dbtype nucl

Building a new DB, current time: 11/22/2021 16:03:00

New DB name: RhW_haplo1

New DB title: haplotype1.fasta

Sequence type: Nucleotide

Keep Linkouts: T

Keep MBits: T

Maximum file size: 1000000000B

Adding sequences from FASTA; added 9 sequences in 17.2862 seconds.

:~/references/Rhwichurana$ makeblastdb -in haplotype2.fasta -out RhW_haplo2 -dbtype nucl

Building a new DB, current time: 11/22/2021 16:03:38

New DB name: RhW_haplo2

New DB title: haplotype2.fasta

Sequence type: Nucleotide

Keep Linkouts: T

Keep MBits: T

Maximum file size: 1000000000B

Adding sequences from FASTA; added 10 sequences in 16.7598 seconds.

:~/references/Rhwichurana$ makeblastdb -in unplaced.fasta -out RhW_trash -dbtype nucl

Building a new DB, current time: 11/22/2021 16:04:28

New DB name: RhW_trash

New DB title: unplaced.fasta

Sequence type: Nucleotide

Keep Linkouts: T

Keep MBits: T

Maximum file size: 1000000000B

Adding sequences from FASTA; added 6 sequences in 0.372215 seconds.

Blastn sur NCBI

Organismes RID Couverture de la requete (mean)
Rosa chinensis TWSU2YKG013 70%
Diplocarpon rosae DortE4 TWR9FRDN016

35% except

DRAngCA10

MDR30 66%

MDR33 90%

Expérimentation 3 sur la méthode d’extraction est-elle la plus adaptée

Je réceptionnne les cinq couples d’amorces MDR

Je prépare des solutions de travail (10µM) en diluant 10µL de solutions mères dans 90µL d’H2O milliQ

Ces solutions sont déposées dans la plaque où sont présents les couples d’amorces DrAng

Amorces F Amorces R - Amorces F Amorces R -
A DRangTC2 DRangTC2 - MDR 30 MDR 30 -
B DRangAG6 DRangAG6 - MDR 33 MDR 33 -
C DRangTC18 DRangTC18 - MDR 104 MDR 104 -
D DRangCA10 DRangCA10 - MDR 112 MDR 112 -
E DRangGA12 DRangGA12 - MDR 113 MDR 113 -
F - - - - - -
G - - - - - -
H - - - - - -

Les tubes de solutions mères sont ensuite numérotés (20.70 à 20.79) et rangés à -20°C.

Essai d’extraction #1 avec NucléoMag Plant kit

La méthode sélectionnée jusqu’à maintenant pour extraire convenablement l’ADNg du champignon (symptome unique sur feuilles agées de Rosier hybride OW) est le NucleoSpin Plant Cf plus haut.

Vu la quantité d’accessions à traiter (~140), je siuhaite automatiser avec le nouveau robot acquis par le plateau ANAN ; IDEAL32.

Matériel : disque foliaire (~15mg) portant une tache noire

OW 9022-A
OW 9125-8
OW 9142-8
OW 9005-8
OW 9073-8
OW 9192-8
OW 9001-8
OW 9018-8

Méthode : https://www.mn-net.com/media/pdf/09/46/a0/Instruction-NucleoMag-Plant.pdf

  • Broyage à sec avec billes acier dans les tubes de prélèvement à l’aide du broyeur Genogrinder (1500g ; 2*40sec.)

  • Extraction avec le protocole NucleoMag Plant

    • Ajout du tampon de lyse ad hoc avec PVP10 et RNAse

    • Incubation dans Thermomixer (Eppendorf) (20minutes, 56°C, 1500g)

    • Centrifugation: 20minutes 13000g

    • Mise en place des surnagents dans la plaque colonne 1

    • Elution : 100µL

    1. A

Remarques de manip :

Le modèle de plaque DeepWell dans laquelle j’ai déposé tous les réactifs n’est pas adapté (trop haute de 5mm)

Je les transfère dans un modèle de plaque adapté, et débute le protocole d’extraction tel que saisi dans le robot.

Les éluats sont en grande majorité encore « contaminés » par des billes.

Je transferts cse éluats dans une plaque AB800 et les dépose sur plaque aimantée 96.

Je récupère les éluats débarassés des billes.

Dosage NanodropOne & Qubit

Nom de l' échantillon AN (µg) Nanodrop A260/A280 A260/A230

AN (µg)

Qubit
9022-B 6 1,232 0,467 2,1
9041-8 12,5 1,316 0,501 2,1
9073-8 23,6 1,323 0,523 2,3
9077-8 23,2 1,295 0,555 1,8
9125-8 19 1,261 0,55 2,2
9142-8 20 1,137 0,634 3,2
9169-8 19 1,305 0,53 2,7
9192-8 23,2 1,389 0,511 2,4

Pour rappel ; les résultats obtenus avec NucleoSpin PlantII

Individus OW a nalysés FW (mg) AN (µg) N anodrop A 260/A280 A 260/A230

AN (µg)

Qubit
OW 9005 14 14,6 2,2 6 2,1
OW 9073 5,6 2,2 2,6 0,7
OW 9192 11,5 2,2 2,3 1,1

Bilan :

Les quantités sont identiques à celle obtenues avec le NucleoSpin Plant II. Elles sont plus homogènes avec la version NucleoMag

Les ratios sont moins bons, signe de contamination en protéines et/ou phénol (A280) de billes, sucres et/ou phénol (A230)

M Leroy (Macherey/Nagel) se déplacera demain (mercrdi 12/01/22) pour m’accompagner dans l’amélioration de ces résultats.

Deux pistes envisagées.

  • Purifier les ADNs extraits ce jour

  • Extraire à nouveau depuis d’autres échantillons que ceux de DiDi: RW-I-7-A

Essai d’extraction #2 avec NucléoMag Plant kit

Matériel : Feuilles RW-I-7-A (Thèse Diana Lopez) broyées au mortier/pilon

Méthode :

  • Distribution de ~15mg dans 6 tubes 2mL.

Tube1-3 : tampon de lyse MC1 (kit nucleomag plant)

Tube4-6: Tampon de lyse PL1* (kit nucleoSpin Plant II).

* Ce tampon dispose de SDS contrairement au MC1

  • Extraction avec le protocole NucleoMag Plant_smallvolume

    • Ajout du tampon de lyse ad hoc avec PVP10 et RNAse

    • Incubation dans Thermomixer (Eppendorf) (20minutes, 56°C, 1500g)

    • Centrifugation: 20minutes 13000g

    • Mise en place des surnagents dans la plaque colonne 1

    • Elution : 80µL

Résultats : Cf plus bas

Bilan : les ratio ne sont pas top (comme pour le test #1)

Proposition d’améliorer la lyse par ajout de protéinaseK

Essai d’extraction #3 avec NucléoMag Plant kit

Matériel : Feuilles RW-I-7-B (Thèse Diana Lopez) broyées au mortier/pilon

Méthode :

  • Distribution de ~15mg dans 6 tubes 2mL.

Tube1-3 : tampon de lyse MC1 (kit nucleomag plant)

Tube4-6: Tampon de lyse PL1* (kitnucleoSpin Plant II).

* Ce tampon dispose de SDS contrairement au MC1

  • Extraction avec le protocole NucleoMag Plant

    • Ajout du tampon de lyse ad hoc avec PVP10 et RNAse

    • Incubation dans Thermomixer (Eppendorf) (10minutes, 56°C, 1500g)

    • Ajout de proteinase K

    • Incubation dans Thermomixer (Eppendorf) (20minutes, 56°C, 1500g)

    • Centrifugation: 20minutes 13000g

    • Mise en place des surnagents dans la plaque colonne 1

    • Elution : 100µL

Résultats : Cf plus bas

Dosage nanodrop & Qubit (DNA broad range)

Essai # Tampon lyse Nom de l'échantillon AN (µg) Nanodrop A260/A280 A260/A230 AN (µg) Qubit
2 MC1 T1-1 12,7 1,077 0,616 1,0
2 MC1 T2-1 11,3 1,245 0,609 1,8
2 MC1 T3-1 8,5 0,968 0,626 3,1
2 PL1 T4-1 9,9 1,041 0,68 1,4
2 PL1 T5-1 9,3 0,963 0,722 1,1
2 PL1 T6-1 10,5 1,076 0,646 1,1
3 MC1 T1-2 20,1 1,158 0,558 0,9
3 MC1 T2-2 12,8 1,049 0,654 1,1
3 MC1 T3-2 17,2 1,145 0,639 1,1
3 PL1 T4-2 6,6 1,003 0,825 0,8
3 PL1 T5-2 11,2 1,02 0,624 0,9
3 PL1 T6-2 17,7 1,292 0,577 0,9

Bilan :

les ratio ne sont pas top (comme pour le test #1)

Ils ne sont pas modifiés par le tampon de lyse, ni par l’apport de protéinase K.

Pistes d’amlioration :

tester le Nucleomag Food avec tampon de lyse CF.

Tester le NucleoMag Microbiome (Cf David Lalanne)

Electrophorèse sur gel d’agarose 1% (135V ; 25min) 2µL de solutions déposées.

Bilan : l’ajout de protéinase K (essai#3) semble améliorer la qualité des bandes d’ADN.

Amplification par PCR :

Matériel :

Couples d’amorces DRAng-TC18 et DRAng-GA12, qDRAng-tropomyosine.

Nom de l'échantillon
1 9022-B
2 9041-8
3 9073-8
4 9077-8
5 9125-8
6 9142-8
7 9169-8
8 9192-8
9 T1-1
10 T1-2
11 OW9005*
12 OW9073*
13 OW0192*

*extractions d’ADN réalisées avec kit Nucleospin Plant II,

Méthode :

* Dilution des échantillons pour apporter leur concentration à 5ng/µL (base : dosage Qubit)

>dilution au ¼ pour OW et echantillons ChIP, dilution au ½ pour T1-1 et T1-2

* Amplification GoTaq Flexi polymérase (Promega)

Mélange réactionnel

1X 15 ech
Tp 5X 3 45
MgCl2 0,9 13,5
dNTP 0,5 7,5
amorce Fw 0,25 3,75
amorce Rev 0,25 3,75
Pol 0,07 1,05
H20 8,03 120,45

Distribution de 13µL dans les 15 puits

Ajout de 2µL d’ADNg (5ng/µL)

Programme : PCR Juju (Tm=55°C) sur Thermocycleur KATY, Résultats :

Les ADNg extrait avec le Nucleospin Plant II permettent les amplifications tandis que ceux extraits avec le NucleoMag Plant ne le permettent pas !

Suite à discussion avec David Lalanne, je pourrais tester le NucleoMag Microbiome.

Essai d’extraction d’ADNg avec lerobot IDEAL32 (plateau ANAN). (24 au 29 janvier 2022)

Contexte : parvenir à extraire des ADNg présentnant une qualité suffisante pour une amplification avec des amorces encadrant des motif SSR

Matériel : Quatre réplications de ~20mg de matière fraiche (feuilles tachées) pour chacune de ces deux conditions biologiques RWI3B ; RWI7B (projet thèse de Diana Lopez Arias)

Méthode : kit NucleoMag Microbiome

  • Ajout de 2% de PVP10 au tampon de lyse MI1

  • Déroule selon le guide.

  • Elution avec 100µL.

Résultats

  • Dosage NanodropOne & Qubit (DNA broad range assay)
Nom de l'échantillon AN (µg) Nanodrop A260/A280 A260/A230 AN (µg) Qubit
RW3B-1 1 1,636 0,853 0,6
RW3B-2 2 1,851 1,275 -
RW3B-3 2,6 1,641 1,123 -
RW3B-4 1,4 1,602 0,858 -
RW7B-1 2,4 1,712 1,083 1,1
RW7B-2 3 1,712 1,184 -
RW7B-3 3,3 1,56 0,77 -
RW7B-4 * 1,2 2,33 1,802 -
RW7B-4p ** 3,3 1,616 0,909 -

*Il reste des billes magnétiques. **la solution a été purgée des billes magnétiques.

Les critères qualités sont améliorés vis à vis de l’extraction avec le NucleoMag Plant..

Pour la condition biologique RW7B, le ratio A260/A280 passe de 1,1 à 1,7 en moyenne, et le ratio A260/A230 de 0,6 à 1,0 en moyenne. Les quantités estimées par les deux méthodes se tiennent dans un ratio 1 :2 voire 1 :3.

  • Migration des ADNg sur gel d’agarose 1% (135V, 25minutes), dépôt de 5µL de solution

  • Amplification

Cf ci-après

Essai de purification d’ADNg

Contexte : Les solutions d’ADNg ont été extraites de huit échantillons du projet DiDi à l’aide du kit NucleoMag Plant. Ces solutions apparaisent jaunes voires roses/marrons. Elles n’ont pas permis d’amplifier les motif SSR DrAngGA12 et DrAng_TC18 ni même une part du gène de la tropomyosine.

Pour ne pas « perdre » ces solutions, je teste un kit proposé par Macheray Nagel

Matériel : Huit solutions extraites le 18/01/2022

Méthode : kit Nucleospin Inhibitor Removal

La variante 5.1 est adoptée et suivi à la lettre avec une élution à 100µL

Résultats

  • Dosage NanodropOne & Qubit (DNA broad range assay)
Nom de l'échantillon AN (µg) Nanodrop A260/A280 A260/A230 AN (µg) Qubit
1 9022-B 1,2 1,775 1,146 0,5
2 9041-8 0,9 1,832 1,378 0,6
3 9073-8 0,8 1,866 0,898 0,5
4 9077-8 1 1,643 1,236 0,6
5 9125-8 1,2 1,827 1,207 0,7
6 9142-8 1,2 1,74 1,177 0,8
7 9169-8 1,2 1,813 1,372 0,9
8 9192-8 1,2 1,755 1,377 0,9

Les critères qualités sont améliorés vis à vis de l’extraction avec le NucleoMag Plant.

Pour la condition biologique RW7B, le ratio A260/A280 passe de 1,2 à 1,8 en moyenne, et le ratio A260/A230 de 0,6 à 1,2 en moyenne. Les quantités estimées par les deux méthodes se tiennent dans un ratio 1 :2 voire 1 :1.

  • Migration des ADNg sur gel d’agarose 1% (135V, 25minutes), dépôt de 5µL de solution

  • Amplification

Bilan :

OK pour contrôle qu’il s’agisse de l’H2O, ou bien de DiFra67 et de Ow9005 (AN isolé avec NucleoSpin PlantII).

Les purifications des solutions d’ADNg avec le kit NucleoSpin Inhibitor removal permettent l’amplification des motifs SSR.

Je n’ai pas d’amplification sur les deux ADNg isolés avec le NucleoMag Microbiome.

Ces tissus étant infectés avec DiFra67, et dans la mesure où le C+ est positif, il s’agit peut être d’un qualité de solution insuffisante. Rw est un génotype de rosier rsistant et empechant le développement du champignon !

A moins que la proportion d’ADNg de champignon soit insuffisante pour être amplifier.

Afaire (vu avec Sophie 

Amplifier les solutions avec des amorces « plante » 

SI amplif sur RWI3 et 7, faire un dernier test d’extraction avec le NucleoMag Microbiome sur 4 echantillons de Didi, avec

Aspects tarifaires :

/pnas1.stockage.inrae.fr/angersnantes-irhs-users$/jjeauffre/Biologie/Budget_cout_manips/Couts_manips_genomique.xlsx

NucleoSpin Plant II (250 Preps) Macherey 740770.250 250 554,4 € 2,2 €
NucleoSpin Plant II (50 Preps) Macherey 740770.50 50 125,2 € 2,5 €
NucleoMag® DNA Microbiome Macherey 744330.1 96 311,8 € 3,2 €
NucleoMag® DNA Microbiome Macherey 744330.4 384 1 114,6 € 2,9 €

Amplifier les solutions extraites avec des amorces « plante » 

(31 janvier au vendredi 04 février 2022)

Matériel :

Couples d’amorces

  • qUBC,

  • KSN_F100*R446,

  • AP2.7_8f*10r

Solutions AN

Nom de l'échantillon
1 9022-B
2 9041-8
3 9073-8
4 9077-8
5 9125-8
6 9142-8
7 9169-8
8 9192-8
9 Rw3I
10 RW7I
11 OW9005*
12 Rw
13 Difra67

*extractions d’ADN réalisées avec kit Nucleospin Plant II,

Méthode :

* Dilution des échantillons pour apporter leur concentration à 5ng/µL (base : dosage Qubit)

* Amplification GoTaq Flexi polymérase (Promega)

Mélange réactionnel

1X 15 ech
Tp 5X 3 45
MgCl2 0,9 13,5
dNTP 0,5 7,5
amorce Fw 0,25 3,75
amorce Rev 0,25 3,75
Pol 0,07 1,05
H20 8,03 120,45

Distribution de 13µL dans les 15 puits

Ajout de 2µL d’ADNg (5ng/µL)

Programme : PCR Juju (Tm=60°C) sur Thermocycleur KATY,

Résultats :

11. 12

Essai d’extraction d’ADNg avec lerobot IDEAL32 (plateau ANAN).

(Le lundi 07 au vendredi 11 mars 2022.)

Contexte : parvenir à extraire des ADNg présentant une qualité suffisante pour une amplification avec des amorces encadrant des motif SSR

Matériel : prélèvement de feuilles emportepiécées autour d’un symptome de tache noire. (~20mg)

Méthode : kit et méthode NucleoMag Microbiome

  • Ajout de 2% de PVP10 au tampon de lyse MI1

  • Déroulé selon le guide (avec ajout de Enhancer et RNAse) et le protocole robot

  • Elution avec 100µL.

Résultats

  • Dosage NanodropOne & Qubit (DNA broad range assay)
Nom de l'échantillon AN (µg) Qubit AN (µg) Nanodrop A260/A280 A260/A230
9001 B 0,471 3,11 1,71 1,25
9018 A 1,2 2,54 1,67 1,08
9022 A 1 2,42 1,77 1,22
9192 A 1,10 2,46 1,74 1,07
9077 7 0,7 1,93 1,67 1,02
9142 7 1 2,04 1,71 1,28
9185 8 0,4 2,39 1,69 0,86
9192 7 0,6 1,72 1,76 1,08

Il reste des billes magnétiques dans les solutions. Elles ont été éliminées par passage sur banc magnétique.

Vis-à-vis de l’essai réalisé en janvier sur les échantillons RWI3/7, les concentrations sont trois à quarte fois supérieures. Les quantités estimées par les deux méthodes se tiennent dans un ratio 1 :2 voire 1 :4.

Le ratio A260/A280 reste identique à 1,7 en moyenne, tout comme le ratio A260/A230 à 1,0 en moyenne.

  • Migration des ADNg sur gel d’agarose 1% (135V, 25minutes), dépôt de 10µL de solution

Les bandes ne sont pas bien « nettes », signe d’une contamination résiduelle en polysaccharides. C’est le cas particulièrement des échantillons non contaminé par le champignon.

Pour l’amplification à venir, il sera necessaire de réaliser une dilution des solutions afin de diluer ces contaminants. J’effectue une dilution 1/3

  • Amplification

Matériel : solutions ADN diluées au 1/3

Méthode :

Mélange réactionnel

1X 15 ech
Tp 5X 3 45
MgCl2 0,9 13,5
dNTP 0,5 7,5
amorce Fw 0,25 3,75
amorce Rev 0,25 3,75
Pol 0,07 1,05
H20 8,03 120,45

Distribution de 11µL dans les 15 puits

Ajout de 4µL d’ADNg dilué

Programme : PCR Juju (Tm=55°C) sur Thermocycleur KATY,

Résultats :

Discussion avec Arnaud Renay et Anne Bernole, Raphaelle Barquet de la plateforme genotypage du Biogeves

Le lundi 11 au vendredi 15 avril A propos du BioGeves-génotypage

Tarif INRAE

Chaine d’analyse KASP validée sur maïs et presque colza

Analyse SSR ; passage a minima d’une demi plaque

Possibilité de se déplacer au Magneraud pour faire tourner la machine à la place des agents et éviter les frais afférents au temps passé.

A propos du projet DiDi

Caractérisation moléculaire du champignon

Souhait d’évaluer les marqueurs présents au labo.

Proposition technique :

atériel]{.underline} :
Nom de AN (µg) AN (µg) A260/A280** A260/A230
l'échantillon** Qubit** Nanodrop**

9001 B 0,471 3,11 1,71 1,25

9018 A 1,2 2,54 1,67 1,08

9022 A 1 2,42 1,77 1,22

9192 A 1,10 2,46 1,74 1,07

9077 7 0,7 1,93 1,67 1,02

9142 7 1 2,04 1,71 1,28

9185 8 0,4 2,39 1,69 0,86

9192 7 0,6 1,72 1,76 1,08 ——————————————————————————–

#Multiplex marker fluorophore amplif_lenght abs_wave_lenght emis_wave_lenght

M1 MDR 30 HEX 185 538 555 M1 MDR 33 FAM 263 495 520 M1 DRangTC-2 ATTO565 384 - 458 570 591 M2 MDR 104 FAM 185 495 520 M2 MDR 112 HEX 534 538 555 M2 DRangCA-10 ATTO565 273 - 299 570 591 M3 DRangTC-18 ATTO565 188 - 262 570 591 M3 DRangGA-12 FAM 285 - 291 495 520 M3 MDR 113F HEX 527 538 555

Méthode:  1.Amplifier en simplex, Fluorophores utilisés par Melanie: FAM, HEX TAMRA (540/565 nm) Selon discussion avec Mélanie Sannier, l’amplification multiplexée a mieux fonctionné que le pool après simplex. confirmer auprès de Anne Bernole du Geves (25/11/22). Amplifier les neufs marqueurs sur huit individus, soit 72 échantillons Matériel: Les individus sont A: mélange de quantité égale d’ADNg extraits de cinq souches de Diplocarpon rosae présentant des profils génétiques variés selon les marqueurs DR-Ang B:mélange de quantité différentes d’ADNg extraits de cinq souches de Diplocarpon rosae présentant des profils génétiques variés selon les marqueurs DR-Ang C:OW9022-A D:OW9192-A E:OW9077-07 F:OW9142-07 G:OW9185-08 H:OW9192-07

Méthode:

Préparation des mélanges A, B Dosage au QuBit (DNA HS) DiFRA35 0,2ng/µL DiFRA67 0,5ng/µL DiKAZ011 0,4µL DiKAZ127 0,8µL Réalisation des mélanges A: DiFRA35 10µL, DiFRA67 4µL, DiKAZ011 5µL, diKAZ127 2,5µL B: 5µL de chaque solutions d’ADNg

Normalisation de la concentration des solutions d’ADNg à 5ng/µL

Amplification en simplex selon le mélange réactionnel suivant: Programme d’amplification PCR Juju (Tm=55°C) sur Thermocycleur KATY

knitr::include_graphics('gels_agarose/20221129_DiDi_testA_QC.Tif')

Les produits de PCR ne sont pas visibles pour MDR30, MDR104, MDR112, CA10 Je refais donc une migration pour ces amplifications sur un autre individu.

knitr::include_graphics('gels_agarose/20221128_genoksntewtltr_testobc.Tif')

  1. migration en simplex puis en multiplex

  2. Diluer les produits d’amplification multiplexé ? Selon discussion avec Mélanie Sannier, pas besoin. L’équipe du BioGeves s’en chargera.

  3. Envoi au geves avec plan de plaque Laboratoire BioGEVES Attn Arnaud Remay Domaine du Magneraud - CS 40052 17 700 Surgères – France

    APPELER Arnaud pour organiser un envoi en interne Navette interne la semaine du du 29/11 **05/12 et 06/12

  4. Migration electrophorétique au Biogeves Passage gratuit possible

6.Rendus Envoi des fichiers fsa et accompagnement à la lecture (pas d’expertise champignon coté GEVES) A voir avec Melanie Sannier qui est OK (03/11/22)

Mail du 14/12/22 Bonjour Julien,

Tu trouveras à l’adresse ci-dessousle dossier zip contenant tous les .fsa de la plaque test que tu nous as fait parvenir. Les fluorochromes ont bien été détectés : HEX en vert (VIC pour nous) et ATTO565 en rouge (PET pour nous). Les échantillons ont été passés après une dilution au 1/20ème, et un pooling M1, M2, M3 a été placé respectivement dans les colonnes 10, 11 et 12. La dilution au 1/20ème est insuffisante car les échantillons saturent. Il faudra affiner cela par la suite. Tu trouveras en pièce jointe le plan de plaque que tu nous as envoyé et sur lequel j’ai mis des commentaires par rapport à l’attendu qui était indiqué dans ton mail du 13 mai. En effet, nous avons constaté que pour deux marqueurs les fluorochromes attendus n’étaient pas les bons (possible inversion de couleur ?). De même pour deux marqueurs, les tailles attendues semblent inversées.

N’hésite pas à revenir vers nous si tu as besoin d’informations complémentaires.

Bonne fin de journée, Anne 0517069603

J’ai transféré les données dans le repertoire ad Hoc créé sur le serveur IRHS Les données sont dans 03_data/001_defaultexp

  1. Analyse des fichiers .fsa J’utilise Geneious et le module Analyzing Microsatellite Traces dont un tutoriel est disponible sur internet J’assigne les pics du marqueur Genescan 500 pour 41 fichiers, en supprimant des pics artefactuels. Je renomme les ficihers en y indiquant les marqueurs quand il s’agit d’amplification simplex. Je saisis les différents loci à l’aide ds infos du fichiers gdo/Genetic_data/DiDi_project/02_material_and_methods/01_protocols/20210330_multiplexedSSRprimers.xlsx Je réalise une détection automatisée de pics puis des bins sur les mélanges 1 & 2 issus du mélange de quatre ADNg extraits de souches monosporées.

Analyse des profils electrophorétiques

Formation à GeneMapper par Annie Chastellier (09/05/24) +Lecture du guide d’usage de GeneMapper https://nextcloud.inrae.fr/s/c4wB5o7N5YBCPbo ## Ouverture du logiciel GeneMapper Depuis l’ordinateur mis à disposition par le plateau ANAN ## Connection avec mon compte utilisateur ## Création d’un nouveau projet File/new project >un projet nommé DiDi_project

Chargement des fichiers

depuis le dossier de travail où sont stockés les fichiers .fsa >Chargement de dix-huit fichiers correspondant à l’amplification des neufs marqueurs SSR sur lles deux mélanges d’ADNg extraits de mycéliums de champignons Diplocarpon rosa e stockés sur le serveur IRHS NB: A la réouverture du projet, le chemin d’accès est quelquesfois “oublié”. Il est alors necessaire de réassocier les fichiers d’entrée (procédure ici)

Association d’une méthode d’analyse aux jeux de données brutes

Création d’une méthode

Chargement d’une méthode en place

La méthode nommée Diplocarpon créée par Laurence est choisie par Annie Je modifie en crant une méthode que je nome Diplocarpon

Création d’un panel de marqueurs

Tools/Panel manager/cliquer sur Panel manager File/New kit Saisir soit le marqueur soit le multiplex de marqueurs Indiquer le Binset

Annie a indiqué le binset nommé Diplocarpon_Brice Je modifie pour créer un binset nommé Diplocarpon rosae Diversity

Spécifier les bins

Sur la base des profils electrophorétiques, identifier les bins Cliquer sur le bouton qui va bien Cliquer sur le marqueur Cliquer droit sur le pic New bin Sur la base des précedentes études menées dans le cadre du projet DiRo, et des profils du mélange je nomme chaque Allele avec le nom de la souche de Diplocarpon

table_allele= read.csv(file= '/../../../../../../../Volumes/gdo/DiDi_project/02_material_and_methods/01_protocols/20240614_allelesDiplo.csv', header=TRUE, sep = ';')

Cela crée des bins qui sont appliqués aux échantillons controle OW9022-A, OW9192-A (prelevement foliaire asymtomatique) et les échantillons d’interets symptomatiques OW9077-7, OW9142-7, OW9192-7, OW9185-8,

Il est possible d’associer des échantillons reference pour chaque marqueur.

J’associe les deux mélanges d’ADNg des quatre souches de Diplocarpon comme reference des quatre marqueurs DRang

Résultats:

La table de gentotypes établie par Brice Marolleau pour les marqueurs angevins est disponible ici La table de génotype obtenue lors de cete étude est disponible ici

genotype_pattern<-read.table(pipe("pbpaste"), sep = "\t", header = TRUE)
## Warning in read.table(pipe("pbpaste"), sep = "\t", header = TRUE): incomplete
## final line found by readTableHeader on 'pbpaste'
genotype_pattern
## [1] X.
## <0 rows> (or 0-length row.names)
genotype_pattern<-as.numeric(unlist(genotype_pattern))
print(genotype_pattern)
## numeric(0)
if (!requireNamespace('BiocManager', quietly = TRUE))
    install.packages('BiocManager')
BiocManager::install('PCAtools')
## Bioconductor version 3.19 (BiocManager 1.30.23), R 4.4.1 (2024-06-14)
## Warning: package(s) not installed when version(s) same as or greater than current; use
##   `force = TRUE` to re-install: 'PCAtools'
## Old packages: 'nlme'
library(PCAtools)
## Loading required package: ggplot2
## Loading required package: ggrepel
## 
## Attaching package: 'PCAtools'
## The following objects are masked from 'package:stats':
## 
##     biplot, screeplot

J’exporte toutes les données associées à l’analyse des profils réalisée avec GeneMapper dans le repertoire suivant smb://147.99.125.236/gdo/DiDi_project/04_data_analysis/990_code_libraries

Bilan:

Des amplifications sont constatées pour chacun des neufs marqueurs SSR sur les contrôles négatifs * de 1 à 6 allèles selon les marqueurs (OW9022-A), * de 1 à 2 allèles selon les marqueurs (OW9192-A ) Des amplifications sont constatées pour chacun des neufs marqueurs SSR sur les deux mélanges d’ADNg extraits de quatre souches Diplocarpon (DiFRA35, DiFRA67, DIKAZ011, DiKAZ180) * un allèle pour les marqueurs MDR33, MDR104 et MDR113 * 2 allèles pour MDR 112, DRangCA-10, DRangGA-12, DRangTC-18 * 3 allèles pour DRangTC-2 * 3 ou 4 allèles pour MDR30

Des amplifications sont constatées pour huit des neufs marqueurs SSR sur les quatre solutions d’ADNg extraites des feuilles symptomatiques de quatre descendants OW. Le marqueur DRangGA-12 ne presente une amplification que sur l’individu OW9142. L’allele est identique à celui retrouvé dans le controle négatif OW9022 asymptomatique. Les deux allèles détectés par le marqueur DRangCA-10 sont différents de ceux identifiés pour les quatre souches du mélange. Les deux allèles détectés par le marqueur DRangTC-18 sont similaires à ceux identifiés pour DiFRA035 et DiKAZ180 L’allèle détecté par le marqueur DRangTC-2 chez les individus OW9077 et OW9142 est similaire à celui identifiés pour DiFRA035. Aucun allèle detecté pour OW9185 et OW9192 L’allèle détecté par le marqueur MDR104 est similaire à celui identifié pour les quatre souches du mélange. L’allèle détecté par les marqueurs MDR112 est similaire à l’un des deux identifiés chez les quatre souches du mélange. Cet allèle est différent de celui détecté chez le controle négatif OW9022-A L’allèle détecté par le marqueur MDR30 est similaire à l’un des quatre identifiés chez les quatre souches du mélange ou le controle négatif OW9022-A Les deux allèles détectés par le marqueur MDR33 sont similaires à ceux identifiés chez le controle négatif OW9022-A et les quatre souches du mélange. [color=#26B260]L’individu OW9192 présente une allèle singulier.[/color] Les sept allèles détectés par le marqueur MDR113 sont similaires à ceux identifiés chez le controle négatif OW9022-A ou les quatre souches du mélange. [color=#26B260]La combinaison d’allèles détectés semble singulière à chaque individu OW[/color]

Point divers :

Note pour le futur: une plaque = 40euros Biogeves-pathogène (Mylène Ruh) Seed extract PCR