Expérimentations préalables

Bioanalyse

conception des amorces d’amplification

1.Je récupère la séquence protéiques des gènes : Leptosphaeria maculans Hypothetical Protein (LEMA_P025150.1) Brassica napus High Mobility Group Protein (NM_001316094.1)

2.Je fais un blastp de ces séquences sur les génomes de Diplocarpon rosae DortE4 et Rosa chinensis OB

Je récupère le best hit et la séquence nucléique RC3G0051100 / RchiOBHmChr3g0493151 (l’allele Chr3g0493151 présente une grosse insertion: TE ?) BU80_DR003485
Je soumets ces deux séquences à l’outil de conception des amorces et sondes taqman de l’entreprise IDT. Je choisis la conception {amorces+sonde fluorescente} en selectinnat les memes quencher et fluorophore que dans l’article publié par Schnippenkoetter en 2021
Je récupère les séquences proposées DrHypProt-F | CATAGTCAGTATCGCCATAGTCG DrHypProt-Pr | TCTCATTCCACTTGAAGTTGCAGCCT DrHypProt-R | TTCGCCATTCGTAGTTCCAG RcOBHMGA-F | TGAAAGATAGCGGTGAGTTGG RcOBHMGA-Pr | TGGGTCCGGCTTTGTGTAGTTGT RcOBHMGA-R | ATCTGGATCCCTGGGTTTTG
Je saisis les séquences des gènes et des amorces dans un dossier de Geneious que je nomme “fungi biomass_evaluation”
Je vérifie la bonne hybridation des amorces et sonde sur les séquences géniques avec l’outil “test with saved primers”.
J’extrait l’amplicon de chaque organisme Diplocarpon rosae et Rosa chinensis OB
Je controle si une hybridation croisée peut se produire par blastn de l’amplicon X sur l’organisme Y avec un mismatch = 6. PAS de MISMATCH 10.Je controle si une hybridation des amorces Diplocarpon rosae pourra avoir lieu sur d’autres souches que DortE4 par blastn de l’amplicon sur DIKAZ_180 (98% identité: trois SNP dont l’un situé au milieu de la séquence de l’amorce F, et l’autre au milieu de la sonde) et DiGER_003 (100% identité).

Je controle si une hybridation des amorces Rosa chinensis OB pourra avoir lieu sur Rosa hybride wichurana par blastn de l’amplicon sur les deux haplotypes.(RW1_chr3: 100% identité; RW2_chr3: 99,5% identité, 1 SNP) L’ensemble de ce dosier de travail est exporté au format Geneious v7 et stocké ici

commande des solutions mères d’amorces d’amplification

Pour 19 euros + 11 euros de frais de port, je commande les solutions mères d’amorces à 100µM Je ne commande pas immédiatement les sondes

Expérimentation biologique test

Reception et préparation des solutions de travail des amorces d’amplification

Je réceptionne les solutions-mères d’amorces le lundi 15 avril. Je prépare ensuite les solutions de travail à 10µM en prélevant 10µL de ces solutions et y en ajoutant 90µL d’eau ultra-pure Je saisis les noms et séquences des amorces dans le fichier excel d’inventaire des amorces de GDO. Je note les tubes avec le numéro interne et les stocke dans le congélateur Hishisaki

test d’amplification n°1

Ce premier test a pour objectif de choisir la température d’hybridation optimale. Matériel Solution d’ADNg RcOB 5ng/µL (plaque ADNg position A1 normalisée préparée par Julien depuis solutions extraites par Julien) Solution d’ADNg DiFRA67 5ng/µL (solution normalisée préparée par Brice Marolleau depuis solutions extraites par ???) Controle -: H2O milliQ couple d’amorces: DrHypProt-F * DrHypProt-R, RcOBHMGA-F * RcOBHMGA-R

Méthode Amplification PCR GoTag Flexi (PROMEGA) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

Distribution de 14µL dans le tube controle - Ajout de 5µL de solution normalisée d’ADNg à chaque mélange réactionnel Distribution de 15µL dans chaque tube Un tube par couple d’amorces/température d’hybridation testée Programme d’amplification: GDO/GRAD 95°C | 3 minutes 95°C | 30 secondes 56°C; 58°C; 60°C; 62°C; 64°C | 30 secondes 72°C | 30 secondes 72°C | 5 minutes 40 cycles d’amplification

instrument: S1000 IRHS000439

Résultat

L’amplification est posible à 60°C pour chaque couple d’amorces

test d’amplification n°2

Ce second test a pour objectif de controler si l’amplification est possible à 60°C sur des solutinos d’ADNg de différentes souches de Diplocarpon rosae et différentes accessions de rosa. Matériel Solution d’ADNg RcOB 5ng/µL (plaque ADNg position A1 normalisée préparée par Julien depuis solutions extraites par Julien) Solution d’ADNg RW 5ng/µL (plaque ADNg normalisée position E1 préparée par Julien depuis solutions extraites par Julien) Solution d’ADNg OW9119 5ng/µL (plaque ADNg normalisée N-20230224-01 position A1 préparée par Annie depuis solutions extraites par ??) Solution d’ADNg Sir Joseph Paxton 5ng/µL (plaque ADNg position D1 normalisée préparée par Julien depuis solutions extraites par Julien) Solution d’ADNg DiFRA67 5ng/µL (solution normalisée préparée par Brice Marolleau depuis solutions extraites par ???) Solution d’ADNg DiGER003 5ng/µL (solution normalisée préparée par Brice Marolleau depuis solutions extraites par ???) Solution d’ADNg DiKAZ180 5ng/µL (solution normalisée préparée par Brice Marolleau depuis solutions extraites par ???) DortE4 Controle -: H2O milliQ couple d’amorces: DrHypProt-F * DrHypProt-R, RcOBHMGA-F * RcOBHMGA-R

Méthode Amplification PCR GoTag Flexi (PROMEGA) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

instrument: S1000 IRHS000439

Résultat

L’amplification est possible à 60°C sur chaque souche de champignon et accessions de rosier. Toutefois, l’amplification pour Diplocarpon rosae apparait moins importante que lors du test1. Le seul changement qui a eu lieu entre les deux tests est le lot du tampon de la taq.

test d’amplification n°2 bis

Ce second test bis a pour objectif de controler si l’amplification est possible à 60°C sur des solutions d’ADNg de différentes souches de Diplocarpon rosae suit eà la faible amplification du test 2. Je décide d’augmenter la concentration d’amorces dans le mix reactionnel pour aligner à celle utiliser courrament en qPCR, soit 333nM Matériel

Solution d’ADNg DiFRA67 5ng/µL (solution normalisée préparée par Brice Marolleau depuis solutions extraites par ???) Solution d’ADNg DiGER003 5ng/µL (solution normalisée préparée par Brice Marolleau depuis solutions extraites par ???) Solution d’ADNg DiKAZ180 5ng/µL (solution normalisée préparée par Brice Marolleau depuis solutions extraites par ???) DortE4 Controle -: H2O milliQ couple d’amorces: DrHypProt-F * DrHypProt-R, RcOBHMGA-F * RcOBHMGA-R

Méthode 1.Dosage des solutions d’ADNG sensées etre à 5ng/µL Réalisé à l’aide du Qubit DNA HS assay DiFRA67= 0.44ng/µL DiGER003= 1.0ng/µL DiKAZ180= 0.28ng/µL DortE4= 0.19ng/µL

2.Amplification PCR GoTag Flexi (PROMEGA) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

Distribution de 14µL dans chaque tube Ajout de 1ng d’ADNg dans chaque tube depuis les solutions “normalisées”

instrument: S1000 IRHS000439

Résultat

Cette fois l’amplification est convenable, sauf peut-etre pour DiKAZ180 qui présente une bande moins intense.

Extraction d’ADNg de champignon DiFRA67 (24/04/2024)

Le prochain test consistera à évaluer l’efficacité et la spécificité d’amplification des amorces en conditions temps réel. Pour cela, j’aurai besoin de réaliser une gamme de dilution de l’ADNg que j’aimerais inscrire dans les capacités mentionnées dans le guide du réactif d’amplification temps réel SsoAdvanced , soit 50ng-5pg La solution dont je dispose présente une concentration insuffisante. JE ne trouve aucune solution d’ADNg suffisamment concentrée dans les affaires stockées dsans le tiroir Maladies foliaires du congélateur IRHS000 JE décide donc de réaliser une extraction depuis du matériel biologique, c’est à dire une culture in vitro de la souche DiFRA67 sur milieu Malt Agar. JE demande à Laurence si je peux disposer d’une culture sur cello. Après discussion avec Jérome, quatre boites de Petri sont disponibles. Il s’agit de cultures sur cello fraiches (i.e pas séchées) qui ont été réalisées pour le microMaster. Laurence réalise un prélèvement de mycélium qu’elle dissous dans un peu d’eau avant de faire une étalement entre lame et lamelle. L’observation au microscope montre des spores typiques de Diplocarpon en forme de pas de chaussures.

Matériel Deux boites de Petri de cultures sur cello fraiches (cycle de repiquage= 06/10/2022; 16/01/2023; 07/03/2024)

Méthodes * Prélèvement sous hotte à flux laminaire de l’ensemble du mycélium de chaque boite Boite 1= 45mg Boite 2= 7mg * Dissolution de la matière dans 200µL d’H2O stérile * Extraction de l’ADNg selon les instructions du kit Quick DNA Fécal/Soil Microbe miniprep kit avec trois modifications: - la lyse est réalisée pendant 20 minutes; dix minutes à température ambiante sur le vortex génie à pleine puissance, dix minutes au thermoshaker 60°C, 950rpm - l’élution est réalisée dans 50µL de tampon d’élution. - La purification n’est pas réalisée faute de colonnes

Résultat * Dosages: | NanoDropOne (260/280, 260/230) | Qubit DNA BR assay Boite 1 | 138 ng/µL (1.9, 0.7) | 171 ng/µL Boite 2 | 104 ng/µL (1.9, 2.0) | 116 ng/µL
### test d’amplification n°3 Ce troisième test a pour objectif de contrôler l’efficacité et la spécificité d’amplification des amorces Diplocarpon rosae et rosa.

Matériel Solution d’ADNg RcOB HPM extraite par moi, le 27/10/2020 dosée à 17ng/µL (Qubit DNA BR). Cette solution est conservée dans la boite Collection ADNg Julien Solution d’ADNg DiFRA67 extraite par moi le 24/04/2024 dosée à 108ng/µL (boite 2). Cette solution est conservée dans la boite Projet DiDi

Méthodes 1.Préparation de la gamme de dilution d’ADNg La solution d’ADNg RcOB HPM extraite le 27/10/2020 dosée à 17ng/µL est laissée telle quelle. Nous l’appelerons solution A 20 µL de la solution d’ADNg DiFRA67 (boite 2) dosée à 108ng/µL est ajoutée à 66,4µL d’H2O milliQ afin d’obtenir une solution dosée à 25ng/µL JE réalise un dosage Qubit DNA BR assay qui montre que la concentration est de 24ng/µL. Nous l’appelerons solution B Des dilutions en cascade sont réalisées à partir de ces deux solutions d’ADNg.

          | Volume solution ADNg (µL)   |  Volume H2O (µL)  | Concentration finale (ng/µL)

Solution A2 | 14,7 (A) | 35,3 | 5 Solution A3 | 7,3 (A) | 42,7 | 2,5 Solution A4 | 5 (A2) | 45 | 0,5 Solution A5 | 5 (A3) | 45 | 0,25 Solution A6 | 5 (A5) | 45 | 0,025 Solution A7 | 5 (A6) | 45 | 0,0025

          | Volume solution ADNg (µL)   |  Volume H2O (µL)  | Concentration finale (ng/µL)

Solution B2 | 10 (B) | 40 | 5 Solution B3 | 5 (B) | 45 | 2,5 Solution B4 | 5 (B2) | 45 | 0,5 Solution B5 | 5 (B3) | 45 | 0,25 Solution B6 | 5 (B5) | 45 | 0,025 Solution B7 | 5 (B6) | 45 | 0,0025

2.Amplification PCR SsoAdvanced Universal Sybr (Bio-RAD) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

tampon 2X | 125µL amorce F | 7,5µL amorce R | 7,5µL H2O milliQ | 60µL *Les amorces sont en concentration finale = 333nM

Distribution de 8µL dans chaque tube Ajout de 2µL de solution d’ADNg dans chaque tube depuis les solutions de la gamme

Programme d’amplification: 20240424_GDO_qPCR_protocol.prcl instrument: Base Serial Number BR007864 Optical Head Serial Number 788BR07464 CFX Maestro Version 4.1.2433.1219.

Résultat

Bilan: Sur Diplocarpon rosae, la spécificité d’hybridation des amorces est OK Sur Rosa chinensis OB, la spécificité d’hybridation des amorces est OK. Sur Diplocarpon rosae, l’amplification est très faible quelque soit la quantité de matrice de départ. L’efficacité d’hybridation des amorces ne peut etre évalué Sur Rosa chinensis OB, l’amplification est linéaire de la quantité de matrice de départ. L’efficacité d’hybridation des amorces est estimée à ~99%. LA taille du génome etant 20 fois moins importante chez DiFRA67 que chez RcOB, le cycle auquel l’amplification sort du bruit de fond devrait etre plus faible pour une meme quantité d’ADNg

Perspectives: 1.Réaliser une amplification en point final sur la gamme de dilution de l’ADNg de Diplocarpon rosae DiFRA67 2.Purifier la solution-mère d’ADNg de Diplocarpon rosae DiFRA67 3.Faire une gamme de dilution avec l’ADNg DortE4 (=race6)

test d’amplification n°4

L’objectif est de vérifier si une amplification a lieu sur les solutions d’ADNg de la gamme de concentration préparée et si elle peut etre detectée après 40 cycles Je testerai deux concentrations d’amorces (333 et 1000µM) et deux réactifs d’amplification (GoTaq Flexi PROMEGA, Ssoadvanced BIO-RAD)

Matériel Solution d’ADNg RcOB HPM extraite par moi, le 27/10/2020 dosée à 17ng/µL (Qubit DNA BR). Cette solution est conservée dans la boite Collection ADNg Julien. C’est le C- Solution d’ADNg DiFRA67 normalisée et concentrée à 0,44ng/µL (boite 2). Cette solution est conservée dans la boite Brice Marolleau La gamme de solutions d’ADNg DiFRA67 préparée par moi le 24/04/2024 depuis une solution mère extraite le 24/04/2024 et dosée à 108ng/µL (boite 2). Cette solution est conservée dans la boite Projet DiDi

Méthodes 1.Amplification PCR GoTag Flexi (PROMEGA) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

2.Amplification PCR SsoAdvanced Universal Sybr (Bio-RAD)) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

tampon 2X | 75µL amorce F | 4,5µL amorce R | 4,5µL H2O milliQ | 46µL *Les amorces sont en concentration finale = 333nM Distribution de 13µL dans chaque tube Ajout de 2µL de solution d’ADNg dans chaque tube

Programme d’amplification: GDO/sso 98°C | 3 minutes 98°C | 5 secondes 60°C | 5 secondes 40 cycles d’amplification instrument: S1000 IRHS000439

3.Amplification PCR GoTag Flexi (PROMEGA) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

Distribution de 13µL dans chaque tube Ajout de 2µL de solution d’ADNg dans chaque tube

4.Amplification PCR SsoAdvanced Universal Sybr (Bio-RAD)) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

tampon 2X | 75µL amorce F | 13,5µL amorce R | 13,5µL H2O milliQ | 28µL *Les amorces sont en concentration finale = 1000nM Distribution de 13µL dans chaque tube Ajout de 2µL de solution d’ADNg dans chaque tube

Programme d’amplification: GDO/sso 98°C | 3 minutes 98°C | 5 secondes 60°C | 5 secondes 40 cycles d’amplification instrument: S1000 IRHS000439

Résultat L’amplification avec la GoTaq Flexi avec les amorces concentrées à 333µM montre des amplificons à des tailles attendues & inattendues à 50ng et 10ng, et le controle positif (DiFRA67 0,44ng/µL). Il n’y a pas d’amplicon dans le controle négatif (RcOB) ni l’eau. L’amplification avec la Ssoadvanced avec les amorces concentrées à 333µM montre des amplificons à des tailles attendues (?) à 50ng et 5ng et 0,5ng, et le controle positif (DiFRA67 0,44ng/µL). Il n’y a pas d’amplicon dans le controle négatif (RcOB) ni l’eau. Les amplifications avec les amorces concentrées à 1000µM montrent des amplificons à des tailles inattendues: à 50ng et 10ng et 1ng et le controle négatif (RcOB) avec la GoTaq Flexi. à 50ng et 10ng et 5ng et 0,5ng avec la Ssoadvanced. *Une amplification à la taille attendue est présente pour le controle positif (DiFRA67 0,44ng/µL) pour chacun des deux mélanges réactionnels.

Question: la matériel que j’ai utilisé pour réaliser l’extraction d’ADNg est-il (encore) du DiFRA67 ?

test d’amplification n°5

Ce cinquiième test a pour objectif de contrôler l’efficacité et la spécificité d’amplification des amorces Diplocarpon rosae sur deux sources d’ADNg de la souche DiFRA67

Matériel Solution d’ADNg DiFRA67 extraite par moi le 24/04/2024 dosée à 108ng/µL (boite 2). Cette solution est conservée dans la boite Projet DiDi.Ce sera la solution nommée A. Solution d’ADNg DiFRA67 extraite et diluée par Brice Marolleau dosée à 0,44ng/µL (Qubit DNA BR). Cette solution est conservée dans la boite Brice 2025-2026-extraction d’ADNg Diplocarpon solutions à 5ng/µL Ce sera la solution nommée B.

Méthodes 1.Préparation de la gamme de dilution d’ADNg Chacune des deux solutions A et B est diluées de manière indépendante de facon à obtenir des solutions A2 à A7. En ce qui concerne la gamme préparée depuis la solution B, les solutions à 5ng/µL et 2,5ng/µL ne sont pas permises et non préparées.

          | Volume solution ADNg (µL)   |  Volume H2O (µL)  | Concentration finale (ng/µL)

          | Volume solution ADNg (µL)   |  Volume H2O (µL)  | Concentration finale (ng/µL)

Solution B4 | 5 (B2) | 45 | 0,5 Solution B5 | 5 (B3) | 45 | 0,25 Solution B6 | 5 (B5) | 45 | 0,025 Solution B7 | 5 (B6) | 45 | 0,0025

2.Amplification PCR SsoAdvanced Universal Sybr (Bio-RAD)) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces

tampon 2X | 125µL amorce F | 7,5µL amorce R | 7,5µL H2O milliQ | 60µL *Les amorces sont en concentration finale = 333nM

Distribution de 8µL dans chaque tube Ajout de 2µL de solution d’ADNg dans chaque tube depuis les solutions de la gamme

Programme d’amplification: 20240424_GDO_qPCR_protocol.prcl instrument: Base Serial Number BR007864 Optical Head Serial Number 788BR07464 CFX Maestro Version 4.1.2433.1219.

Résultat Bilan: Sur la Solution d’ADNg DiFRA67 extraite par moi le 24/04/2024 dosée à 108ng/µL (boite 2), la spécifité et l’efficacité d’amplification ne remplissent pas les critères qualité requis par le MIQE. Sur la Solution d’ADNg DiFRA67 extraite et diluée par Brice Marolleau dosée à 0,44ng/µL, la spécifité et l’efficacité d’amplification remplissent les critères qualité requis par le MIQE: un seul pic de melt curve, une efficacité = 93,7% (comprise entre 85% et 115%)

Perspectives: 1.Acheter un kit NucleoMag Microbiome au prix de 349,63€HT sur UGAP. 2.Avec le robot IDEAL32, Réaliser l’extraction d’ADNg des échantillons végétaux prélevés dans le cadre de la thèse de Diana : les points de la cinétique d’inoculation débutée avec 100000 spores de DiFRA67, sur le réplicat biologique B. Il faudra suivre les modifications suivantes; Ajout de 2% de PVP10 au tampon de lyse MI1 + Déroule selon le guide + Elution avec 100µL.

3.Réaliser l’amplification en temps réel des deux gènes (RcOB et Dr) sur ces solutions d’ADNg en y incluant celles extraites en janvier 2022 (RW-3dpi et RW-7dpi) . Cf cahier de manipulation Jeauffre_genotyping_analysis_labBook.rmd. Elles avaient été extraites de deux échantillons de la cinétique

Expérimentation biologique n°1

Extraction des ADNg:

Matériel biologique:

samples<-read.csv("/Users/jjeaufre-admin/Documents/INRAE/Biologie/LabBook/GDO/Diplo_biomass/20240805_DNAisolation.csv", header = TRUE, sep = ";")
samples$Echantillons

##  [1]  1  2  3  4  5  6  7  8  9 10

samples$Genotype

##  [1] "OB" "OB" "OB" "OB" "RW" "RW" "OB" "RW" "RW" "RW"

samples$Condition_expe..1

##  [1] "I"  "I"  "I"  "I"  "I"  "I"  "NI" "NI" "I"  "I"

name_sample<-factor(paste(samples$Genotype, samples$Condition_expe..1, samples$Condition_expe..2, samples$Replicat_bio, sep = "_"))
name_sample

##  [1] OB_I_0_B  OB_I_3_B  OB_I_5_B  OB_I_7_B  RW_I_0_B  RW_I_5_B  OB_NI_7_B
##  [8] RW_NI_7_B RW_I_3_B  RW_I_7_B 
## 10 Levels: OB_I_0_B OB_I_3_B OB_I_5_B OB_I_7_B OB_NI_7_B RW_I_0_B ... RW_NI_7_B

Méthode:

kit NucleoMag Microbiome modifié Lyse: MI1 + 2% PVP10 + Enhancer + RNAse (Macherey/Nagel, )+ Protéinase K (NEB, P8107S) Incubation 8 minutes à 60°C Lavages: réalisé au robot IDEAL32 selon le programme NucleoMag Microbiome Elution: 100µL

Résultats:

results<-data.frame(name_sample,samples$Genotype,samples$Condition_expe..1,samples$Condition_expe..2,samples$Replicat_bio, samples$Acide.nucléique.ng.uL._Qubit_DNABR)
results

##    name_sample samples.Genotype samples.Condition_expe..1
## 1     OB_I_0_B               OB                         I
## 2     OB_I_3_B               OB                         I
## 3     OB_I_5_B               OB                         I
## 4     OB_I_7_B               OB                         I
## 5     RW_I_0_B               RW                         I
## 6     RW_I_5_B               RW                         I
## 7    OB_NI_7_B               OB                        NI
## 8    RW_NI_7_B               RW                        NI
## 9     RW_I_3_B               RW                         I
## 10    RW_I_7_B               RW                         I
##    samples.Condition_expe..2 samples.Replicat_bio
## 1                          0                    B
## 2                          3                    B
## 3                          5                    B
## 4                          7                    B
## 5                          0                    B
## 6                          5                    B
## 7                          7                    B
## 8                          7                    B
## 9                          3                    B
## 10                         7                    B
##    samples.Acide.nucléique.ng.uL._Qubit_DNABR
## 1                                         2.2
## 2                                         3.6
## 3                                         2.3
## 4                                         3.9
## 5                                         4.4
## 6                                         4.9
## 7                                         6.0
## 8                                         5.7
## 9                                         4.5
## 10                                        7.3

summary(results)

##     name_sample samples.Genotype   samples.Condition_expe..1
##  OB_I_0_B :1    Length:10          Length:10                
##  OB_I_3_B :1    Class :character   Class :character         
##  OB_I_5_B :1    Mode  :character   Mode  :character         
##  OB_I_7_B :1                                                
##  OB_NI_7_B:1                                                
##  RW_I_0_B :1                                                
##  (Other)  :4                                                
##  samples.Condition_expe..2 samples.Replicat_bio
##  Min.   :0.0               Length:10           
##  1st Qu.:3.0               Class :character    
##  Median :5.0               Mode  :character    
##  Mean   :4.4                                   
##  3rd Qu.:7.0                                   
##  Max.   :7.0                                   
##                                                
##  samples.Acide.nucléique.ng.uL._Qubit_DNABR
##  Min.   :2.200                             
##  1st Qu.:3.675                             
##  Median :4.450                             
##  Mean   :4.480                             
##  3rd Qu.:5.500                             
##  Max.   :7.300                             
##

Group<-samples$Genotype
if (!requireNamespace("BiocManager"))
    install.packages("BiocManager")

## Loading required namespace: BiocManager

BiocManager::install(c("org.Mm.eg.db", "ggplot2", "dplyr", "pheatmap"))

## Bioconductor version 3.19 (BiocManager 1.30.23), R 4.4.1 (2024-06-14)

## Warning: package(s) not installed when version(s) same as or greater than current; use
##   `force = TRUE` to re-install: 'org.Mm.eg.db' 'ggplot2' 'dplyr' 'pheatmap'

library(ggplot2)
p <- ggplot(results, aes(x=name_sample, y=results$samples.Acide.nucléique.ng.uL._Qubit_DNABR, fill=results$samples.Genotype)) + geom_col() + xlab("Samples") + ylab("Nuc_acid_Conc") + labs(fill = Group) + theme_bw() +
    theme(axis.text.x = element_text(angle=90)) + ggtitle("DNA isolation")
p

## Warning: Use of `results$samples.Acide.nucléique.ng.uL._Qubit_DNABR` is discouraged.
## ℹ Use `samples.Acide.nucléique.ng.uL._Qubit_DNABR` instead.

## Warning: Use of `results$samples.Genotype` is discouraged.
## ℹ Use `samples.Genotype` instead.

Amplification SsoAdvanced Universal Sybr (Bio-RAD) des deux cibles (Rosier & champignon):

Matériel biologique:

Les dix solutions d’ADNg extraites par la méthode NucleoMag Microbiome

DNAsolutions <-data.frame(samples$Echantillons, results)
print(DNAsolutions)

##    samples.Echantillons name_sample samples.Genotype samples.Condition_expe..1
## 1                     1    OB_I_0_B               OB                         I
## 2                     2    OB_I_3_B               OB                         I
## 3                     3    OB_I_5_B               OB                         I
## 4                     4    OB_I_7_B               OB                         I
## 5                     5    RW_I_0_B               RW                         I
## 6                     6    RW_I_5_B               RW                         I
## 7                     7   OB_NI_7_B               OB                        NI
## 8                     8   RW_NI_7_B               RW                        NI
## 9                     9    RW_I_3_B               RW                         I
## 10                   10    RW_I_7_B               RW                         I
##    samples.Condition_expe..2 samples.Replicat_bio
## 1                          0                    B
## 2                          3                    B
## 3                          5                    B
## 4                          7                    B
## 5                          0                    B
## 6                          5                    B
## 7                          7                    B
## 8                          7                    B
## 9                          3                    B
## 10                         7                    B
##    samples.Acide.nucléique.ng.uL._Qubit_DNABR
## 1                                         2.2
## 2                                         3.6
## 3                                         2.3
## 4                                         3.9
## 5                                         4.4
## 6                                         4.9
## 7                                         6.0
## 8                                         5.7
## 9                                         4.5
## 10                                        7.3

Les amorces du gène DrHypProt, et du gène RcHMGA #### Méthode: Amplification PCR SsoAdvanced Universal Sybr (Bio-RAD) Mélange réactionnel: un par couple d’amorces pour 36 puits

tampon 2X | 180µL amorce F | 10,8µL amorce R | 10,8µL H2O milliQ | 86,4µL *Les amorces sont en concentration finale = 333nM

Distribution de 8µL dans chaque tube Ajout de 2µL de solution d’ADNg dans chaque tube depuis les solutions-mère d’ADNg. Cela occasionne une différence de quantité d’ADNg inter-échantillons. La gamme de quantité va de 4,4ng (OB-I-0-B) à 14,6ng (RW-I-7-B)

Programme d’amplification: 20240424_GDO_qPCR_protocol.prcl instrument: Base Serial Number BR005886 CFX Manager Version 3.1.1517.0823.

Résultats:

qPCRresults<-read.csv("/Users/jjeaufre-admin/Documents/INRAE/Biologie/LabBook/GDO/Diplo_biomass/2024-08-06_biomasfungi_expe1 -  Quantification Cq Results_0.csv", header = TRUE, sep = ";")
qPCRresults

##     X Well Fluor Target Content    Sample Biological.Set.Name               Cq
## 1  NA  A11  SYBR     dr     NTC        L5                  NA              NaN
## 2  NA  B11  SYBR     dr     NTC        L5                  NA              NaN
## 3  NA  C11  SYBR     dr     NTC        L5                  NA              NaN
## 4  NA  A01  SYBR     dr Unkn-01  OB-I-0-B                  NA 30,8898961722313
## 5  NA  B01  SYBR     dr Unkn-01  OB-I-0-B                  NA 31,7963991424038
## 6  NA  C01  SYBR     dr Unkn-01  OB-I-0-B                  NA 32,7658792935916
## 7  NA  E01  SYBR     rc Unkn-13  OB-I-0-B                  NA 21,2881573329391
## 8  NA  F01  SYBR     rc Unkn-13  OB-I-0-B                  NA  20,975649530943
## 9  NA  G01  SYBR     rc Unkn-13  OB-I-0-B                  NA 20,8946753669595
## 10 NA  A02  SYBR     dr Unkn-02  OB-I-3-B                  NA 33,1990488023944
## 11 NA  B02  SYBR     dr Unkn-02  OB-I-3-B                  NA 36,7889308042326
## 12 NA  C02  SYBR     dr Unkn-02  OB-I-3-B                  NA 35,2426482668667
## 13 NA  E02  SYBR     rc Unkn-14  OB-I-3-B                  NA 20,7851708680096
## 14 NA  F02  SYBR     rc Unkn-14  OB-I-3-B                  NA 20,6545939614419
## 15 NA  G02  SYBR     rc Unkn-14  OB-I-3-B                  NA 20,6452146151208
## 16 NA  A03  SYBR     dr Unkn-03  OB-I-5-B                  NA 36,6362715734071
## 17 NA  B03  SYBR     dr Unkn-03  OB-I-5-B                  NA 36,5830177269514
## 18 NA  C03  SYBR     dr Unkn-03  OB-I-5-B                  NA              NaN
## 19 NA  E03  SYBR     rc Unkn-15  OB-I-5-B                  NA 21,3576968573807
## 20 NA  F03  SYBR     rc Unkn-15  OB-I-5-B                  NA 21,1749146421862
## 21 NA  G03  SYBR     rc Unkn-15  OB-I-5-B                  NA 21,3082545094285
## 22 NA  A04  SYBR     dr Unkn-04  OB-I-7-B                  NA 33,3427095354187
## 23 NA  B04  SYBR     dr Unkn-04  OB-I-7-B                  NA 31,9317170897445
## 24 NA  C04  SYBR     dr Unkn-04  OB-I-7-B                  NA 32,8028195435272
## 25 NA  E04  SYBR     rc Unkn-16  OB-I-7-B                  NA 20,7593539481199
## 26 NA  F04  SYBR     rc Unkn-16  OB-I-7-B                  NA 20,5885733609106
## 27 NA  G04  SYBR     rc Unkn-16  OB-I-7-B                  NA  20,589833964664
## 28 NA  A09  SYBR     dr Unkn-09 OB-NI-7-B                  NA              NaN
## 29 NA  B09  SYBR     dr Unkn-09 OB-NI-7-B                  NA              NaN
## 30 NA  C09  SYBR     dr Unkn-09 OB-NI-7-B                  NA              NaN
## 31 NA  E09  SYBR     rc Unkn-21 OB-NI-7-B                  NA 20,0744035886809
## 32 NA  F09  SYBR     rc Unkn-21 OB-NI-7-B                  NA 20,0266094134518
## 33 NA  G09  SYBR     rc Unkn-21 OB-NI-7-B                  NA 19,9230752968398
## 34 NA  A05  SYBR     dr Unkn-05  RW-I-0-B                  NA 31,7491127408825
## 35 NA  B05  SYBR     dr Unkn-05  RW-I-0-B                  NA 31,0374570644912
## 36 NA  C05  SYBR     dr Unkn-05  RW-I-0-B                  NA 31,8185114865786
## 37 NA  E05  SYBR     rc Unkn-17  RW-I-0-B                  NA 20,5095241098152
## 38 NA  F05  SYBR     rc Unkn-17  RW-I-0-B                  NA 20,1759376572036
## 39 NA  G05  SYBR     rc Unkn-17  RW-I-0-B                  NA 20,0879462094125
## 40 NA  A06  SYBR     dr Unkn-06  RW-I-3-B                  NA              NaN
## 41 NA  B06  SYBR     dr Unkn-06  RW-I-3-B                  NA              NaN
## 42 NA  C06  SYBR     dr Unkn-06  RW-I-3-B                  NA              NaN
## 43 NA  E06  SYBR     rc Unkn-18  RW-I-3-B                  NA 23,6431254733353
## 44 NA  F06  SYBR     rc Unkn-18  RW-I-3-B                  NA 22,4080953235224
## 45 NA  G06  SYBR     rc Unkn-18  RW-I-3-B                  NA 23,3556671554282
## 46 NA  A07  SYBR     dr Unkn-07  RW-I-5-B                  NA 35,6198629248071
## 47 NA  B07  SYBR     dr Unkn-07  RW-I-5-B                  NA 32,6817225575423
## 48 NA  C07  SYBR     dr Unkn-07  RW-I-5-B                  NA  31,647854243606
## 49 NA  E07  SYBR     rc Unkn-19  RW-I-5-B                  NA  20,445441021066
## 50 NA  F07  SYBR     rc Unkn-19  RW-I-5-B                  NA 20,1359685344887
## 51 NA  G07  SYBR     rc Unkn-19  RW-I-5-B                  NA 20,0171602184351
## 52 NA  A08  SYBR     dr Unkn-08  RW-I-7-B                  NA 34,8257520310033
## 53 NA  B08  SYBR     dr Unkn-08  RW-I-7-B                  NA 36,4903722147992
## 54 NA  C08  SYBR     dr Unkn-08  RW-I-7-B                  NA 35,4146506216267
## 55 NA  E08  SYBR     rc Unkn-20  RW-I-7-B                  NA 19,6725686995278
## 56 NA  F08  SYBR     rc Unkn-20  RW-I-7-B                  NA 19,6490233588157
## 57 NA  G08  SYBR     rc Unkn-20  RW-I-7-B                  NA 19,7037584390134
## 58 NA  A10  SYBR     dr Unkn-10 RW-NI-7-B                  NA              NaN
## 59 NA  B10  SYBR     dr Unkn-10 RW-NI-7-B                  NA              NaN
## 60 NA  C10  SYBR     dr Unkn-10 RW-NI-7-B                  NA              NaN
## 61 NA  E10  SYBR     rc Unkn-22 RW-NI-7-B                  NA 19,9506440139689
## 62 NA  F10  SYBR     rc Unkn-22 RW-NI-7-B                  NA 19,8025300797346
## 63 NA  G10  SYBR     rc Unkn-22 RW-NI-7-B                  NA 19,6967600281228
## 64 NA  E11  SYBR     rc     NTC                            NA              NaN
## 65 NA  F11  SYBR     rc     NTC                            NA              NaN
## 66 NA  G11  SYBR     rc     NTC                            NA              NaN
##             Cq.Mean        Cq.Std..Dev Starting.Quantity..SQ.
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## 66                   NaN       0           0        60        NA

Je suis la méthode décrite dans l’article (Schnippenkoetter?) pour * déterminer la quantité d’ADNG de Diplocarpon rosae et de Rosa dans chaque échantillon biologique en suivant la méthode absolue selon les deux gammes de dilution réalisées lors des test 3 et 5 * normaliser la quantité d’ADNG de Diplocarpon rosae vis à vis de celle Rosa

fungibiomass<-read.csv("/Users/jjeaufre-admin/Documents/INRAE/Biologie/LabBook/GDO/Diplo_biomass/20240812-synthesebiomassexpe1.csv", header = TRUE, sep =";")
head(fungibiomass)

##   Accession Time Samples.name QuantitÈ.ADNg.Dr..ng. QuantitÈ.ADNg.Rc..ng.
## 1        OB    0     OB-I-0-B           0,003217339           5,385968763
## 2        OB    3     OB-I-3-B           0,000372874           6,887488712
## 3        OB    5     OB-I-5-B           0,000135345           4,606563962
## 4        OB    7     OB-I-7-B           0,001804018           7,123720166
## 5        OB   NA    OB-NI-7-B                     0           11,04302294
## 6        RW    0     RW-I-0-B           0,003877711           9,301267914
##   QuantitÈ.ADNg.Dr.normalisÈe..ng.
## 1                      0,000597356
## 2                         5,41E-05
## 3                         2,94E-05
## 4                      0,000253241
## 5                                0
## 6                      0,000416901

str(fungibiomass)

## 'data.frame':    10 obs. of  6 variables:
##  $ Accession                       : chr  "OB" "OB" "OB" "OB" ...
##  $ Time                            : int  0 3 5 7 NA 0 3 5 7 NA
##  $ Samples.name                    : chr  "OB-I-0-B" "OB-I-3-B" "OB-I-5-B" "OB-I-7-B" ...
##  $ QuantitÈ.ADNg.Dr..ng.           : chr  "0,003217339" "0,000372874" "0,000135345" "0,001804018" ...
##  $ QuantitÈ.ADNg.Rc..ng.           : chr  "5,385968763" "6,887488712" "4,606563962" "7,123720166" ...
##  $ QuantitÈ.ADNg.Dr.normalisÈe..ng.: chr  "0,000597356" "5,41E-05" "2,94E-05" "0,000253241" ...

print(fungibiomass)

##    Accession Time Samples.name QuantitÈ.ADNg.Dr..ng. QuantitÈ.ADNg.Rc..ng.
## 1         OB    0     OB-I-0-B           0,003217339           5,385968763
## 2         OB    3     OB-I-3-B           0,000372874           6,887488712
## 3         OB    5     OB-I-5-B           0,000135345           4,606563962
## 4         OB    7     OB-I-7-B           0,001804018           7,123720166
## 5         OB   NA    OB-NI-7-B                     0           11,04302294
## 6         RW    0     RW-I-0-B           0,003877711           9,301267914
## 7         RW    3     RW-I-3-B                     0           1,287191765
## 8         RW    5     RW-I-5-B           0,001194114           9,681348969
## 9         RW    7     RW-I-7-B           0,000267903           13,88184128
## 10        RW   NA    RW-NI-7-B                     0            12,5952709
##    QuantitÈ.ADNg.Dr.normalisÈe..ng.
## 1                       0,000597356
## 2                          5,41E-05
## 3                          2,94E-05
## 4                       0,000253241
## 5                                 0
## 6                       0,000416901
## 7                                 0
## 8                       0,000123342
## 9                          1,93E-05
## 10                                0

fungibiomass$Accession<-factor(fungibiomass$Accession)
fungibiomass$Samples.name<-factor(fungibiomass$Samples.name)
help(barplot)
graph<- ggplot(fungibiomass, aes(x=fungibiomass$Samples.name, y=fungibiomass$QuantitÈ.ADNg.Dr.normalisÈe..ng., fill=fungibiomass$Accession)) +
    geom_col() + xlab("Samples") + ylab("Normalised quantity (ng)") + labs(fill = "Accession") + theme_bw() +
    theme(axis.text.x = element_text(angle=90)) + ggtitle("Normalised quantity of Diplocapon rosae in DiFRA67-spreaded-rose leaves")
graph

## Warning: Use of `fungibiomass$Samples.name` is discouraged.
## ℹ Use `Samples.name` instead.

## Warning: Use of `fungibiomass$QuantitÈ.ADNg.Dr.normalisÈe..ng.` is discouraged.
## ℹ Use `QuantitÈ.ADNg.Dr.normalisÈe..ng.` instead.

## Warning: Use of `fungibiomass$Accession` is discouraged.
## ℹ Use `Accession` instead.

print(graph)

## Warning: Use of `fungibiomass$Samples.name` is discouraged.
## ℹ Use `Samples.name` instead.

## Warning: Use of `fungibiomass$QuantitÈ.ADNg.Dr.normalisÈe..ng.` is discouraged.
## ℹ Use `QuantitÈ.ADNg.Dr.normalisÈe..ng.` instead.

## Warning: Use of `fungibiomass$Accession` is discouraged.
## ℹ Use `Accession` instead.

Bilan:

Dans les feuilles inoculées par une solution d’eau osmosée, la quantité de Diplocarpon Rosae à T=7 est de 0 pg chez OB et RW. Aucune trace du hampignon n’est détecté. Dans les feuilles inoculées par une solution de DiFRA67 100k spores, la quantité de Diplocarpon Rosae à T=0 est de 0,6pg chez OB et 0,4pg chez RW . Rappel, ce T=0 est prélevé 15 minutes après l’inoculation. A T=3, la quantité de champignon est de 5pg chez OB et de 0pg chez RW. A T=5, la quantité de champignon est de 3pg chez OB et de 0,1pg chez RW. A T=7, la quantité de champignon est de 0,2pg chez OB et de 2pg chez RW.

Interpératation biologique:

A voir avec Sophie Paillard selon la thèse de Diana Lopez-Arias.

Perspectives:

Pour rappel, la quantité de matériel végétal utilisée pour l’extraction d’ADNg est de 30mg et le volume d’élution de l’ADNg est de 100µL . Ces deux aspects ont eu pour conséquence d’obtenir des concentrations d’ADNg inférieures à 10ng/µL.

Par ailleurs, le volume de matrice utilisé pour l’amplification en temps réel est resté celui uilisé classiquement dans les expériences trnacriptomiques, soit 2µL, soit 14 ng maximum. Cela n’a pas permis de reproduire les conditions (50ng) de l’article publié par (Schnippenkoetter?) en 2021

Malgré tout, les quantités minimales détectées sont inférieures au picogramme ce qui en fait une méthode sensible. Afin d’optimiser les résultats, les trois facteurs pourraient etre modulés

1- à la baisse pour le volume d’élution utilisée pour l’extraction d’ADNg 2- à la hausse pour la quantité de matériel végétal utilisée pour l’extraction d’ADNg & le volume de matrice utilisé pour l’amplification en temps réel

Diplocarpon rosae biomass evaluation

Julien Jeauffre

2024-04-10

Description générale

Acteurs:

Objectifs

Méthode

Expérimentations préalables

Bioanalyse

conception des amorces d’amplification

commande des solutions mères d’amorces d’amplification

Expérimentation biologique test

Reception et préparation des solutions de travail des amorces d’amplification

test d’amplification n°1

test d’amplification n°2

test d’amplification n°2 bis

Extraction d’ADNg de champignon DiFRA67 (24/04/2024)

test d’amplification n°4

test d’amplification n°5

Expérimentation biologique n°1

Extraction des ADNg:

Matériel biologique:

Méthode:

Résultats:

Amplification SsoAdvanced Universal Sybr (Bio-RAD) des deux cibles (Rosier & champignon):

Matériel biologique:

Résultats:

Bilan:

Interpératation biologique:

Perspectives: