WORKFLOW BIOINFORMÁTICO PARA META ANALISE DE EXPRESSÃO DIFERENCIAL EM DADOS DE RNASEQ

Install package

Faça o download do binario do pacote R a partir do github metaDEG e o instale conforme o código a seguir

install.packages("D:/METADEG/metadeg_0.0.0.1000.tar.gz", repos = NULL, type = "source")
## Installing package into 'C:/Users/bruno/AppData/Local/R/win-library/4.3'
## (as 'lib' is unspecified)

Preparação dos Dados:

1. Preparação dos Dados

# Carregar pacotes necessários
library(limma)
library(edgeR)
library(meta)
## Warning: package 'meta' was built under R version 4.3.3
## Carregando pacotes exigidos: metadat
## Warning: package 'metadat' was built under R version 4.3.3
## Loading 'meta' package (version 7.0-0).
## Type 'help(meta)' for a brief overview.
## Readers of 'Meta-Analysis with R (Use R!)' should install
## older version of 'meta' package: https://tinyurl.com/dt4y5drs
# Criar dados de contagem normalizados para três estudos
set.seed(123)
counts_study1 <- data.frame(
    SampleID = paste0("Sample", 1:8),
    Gene1 = rpois(8, lambda=10),
    Gene2 = rpois(8, lambda=15),
    Gene3 = rpois(8, lambda=20)
)

counts_study2 <- data.frame(
    SampleID = paste0("Sample", 9:16),
    Gene1 = rpois(8, lambda=11),
    Gene2 = rpois(8, lambda=16),
    Gene3 = rpois(8, lambda=21)
)

counts_study3 <- data.frame(
    SampleID = paste0("Sample", 17:24),
    Gene1 = rpois(8, lambda=9),
    Gene2 = rpois(8, lambda=14),
    Gene3 = rpois(8, lambda=19)
)
counts_study1
##   SampleID Gene1 Gene2 Gene3
## 1  Sample1     8     8    19
## 2  Sample2     9    19    16
## 3  Sample3    14    16    15
## 4  Sample4    10    16    18
## 5  Sample5    10    15    15
## 6  Sample6    15    12    17
## 7  Sample7    11    20    19
## 8  Sample8     5    18    14
# Criar metadados para cada estudo
metadata_study1 <- data.frame(
    SampleID = paste0("Sample", 1:8),
    Diagnosis = rep(c("Case", "Control"), each=4),
    Donor = rep(paste0("Donor", 1:4), times=2),
    Study = rep("Study1", 8)
)

metadata_study2 <- data.frame(
    SampleID = paste0("Sample", 9:16),
    Diagnosis = rep(c("Case", "Control"), each=4),
    Donor = rep(paste0("Donor", 5:8), times=2),
    Study = rep("Study2", 8)
)

metadata_study3 <- data.frame(
    SampleID = paste0("Sample", 17:24),
    Diagnosis = rep(c("Case", "Control"), each=4),
    Donor = rep(paste0("Donor", 9:12), times=2),
    Study = rep("Study3", 8)
)
metadata_study1
##   SampleID Diagnosis  Donor  Study
## 1  Sample1      Case Donor1 Study1
## 2  Sample2      Case Donor2 Study1
## 3  Sample3      Case Donor3 Study1
## 4  Sample4      Case Donor4 Study1
## 5  Sample5   Control Donor1 Study1
## 6  Sample6   Control Donor2 Study1
## 7  Sample7   Control Donor3 Study1
## 8  Sample8   Control Donor4 Study1

2. Análise de Expressão Diferencial Usando limma-voom

# Pacotes necessários
library(limma)
library(edgeR)
library(MASS)  # Para o pseudo count

# Realizar a análise de expressão diferencial para cada estudo
DE_results_study1 <- metadeg::diff_expression(counts_study1, metadata_study1)
DE_results_study2 <- metadeg::diff_expression(counts_study2, metadata_study2)
DE_results_study3 <- metadeg::diff_expression(counts_study3, metadata_study3)
DE_results_study1
##             logFC  AveExpr          t   P.Value adj.P.Val         B
## Gene1 -0.07327334 17.86515 -0.2497132 0.8056367 0.8997907 -4.646540
## Gene2  0.04977992 18.45409  0.2121359 0.8343847 0.8997907 -4.680835
## Gene3  0.01905374 18.59079  0.1277148 0.8997907 0.8997907 -4.765059

3. Realizar a Meta-Análise

# Combinar resultados de DE para a meta-análise
DE_results_list <- list(DE_results_study1, DE_results_study2, DE_results_study3)
meta_results <- metadeg::metaDEG(DE_results_list)

# Visualizar os resultados da meta-análise
meta_results
##    Gene  EffectSize    StdErr   p.value     p.adj
## 1 Gene1 0.006095957 0.1715450 0.9716526 0.9716526
## 2 Gene2 0.027284262 0.1158034 0.8137366 0.9716526
## 3 Gene3 0.016970869 0.1266248 0.8933830 0.9716526

Interpretar os resultados da meta-análise de expressão diferencial envolve entender como os tamanhos de efeito combinados e os valores de p se traduzem em conclusões sobre a expressão gênica diferencial entre casos e controles através de múltiplos estudos. Aqui está um guia detalhado sobre como interpretar esses resultados:

Resultados da Análise de Expressão Diferencial Individual

Para cada estudo individual (usando limma-voom), os resultados típicos incluem:

  • logFC (log fold-change): Representa a mudança logarítmica na expressão gênica entre os casos e controles. Valores positivos indicam aumento na expressão nos casos em comparação aos controles, e valores negativos indicam diminuição.

  • AveExpr (expressão média): Expressão média do gene em todas as amostras.

  • t (estatística t): Medida da relação entre o coeficiente estimado (logFC) e seu erro padrão.

  • P.Value (valor p): Significância estatística do coeficiente estimado. Valores menores indicam maior evidência contra a hipótese nula.

  • adj.P.Val (valor p ajustado): Valor p ajustado para múltiplos testes usando o método FDR (False Discovery Rate).

Resultados da Meta-Análise

Após combinar os resultados dos estudos individuais, a tabela meta_results inclui:

  • Gene: Nome do gene.

  • EffectSize: Tamanho do efeito combinado (geralmente uma média ponderada dos logFCs dos estudos individuais).

  • StdErr: Erro padrão do tamanho do efeito combinado.

  • p.value: Valor p da meta-análise, indicando a significância estatística do tamanho do efeito combinado.

  • p.adj: Valor p ajustado para múltiplos testes na meta-análise.

    meta_results
    ##    Gene  EffectSize    StdErr   p.value     p.adj
## 1 Gene1 0.006095957 0.1715450 0.9716526 0.9716526
## 2 Gene2 0.027284262 0.1158034 0.8137366 0.9716526
## 3 Gene3 0.016970869 0.1266248 0.8933830 0.9716526

Como Interpretar os Resultados da Meta-Análise

  1. Tamanho do Efeito Combinado (EffectSize):

    • Um tamanho de efeito positivo indica que o gene é, em média, mais expresso nos casos do que nos controles através dos estudos.

    • Um tamanho de efeito negativo indica que o gene é, em média, menos expresso nos casos do que nos controles.

    • Quanto maior o valor absoluto do tamanho do efeito, mais forte é a diferença na expressão gênica entre os casos e controles.

  2. Erro Padrão (StdErr):

    • Fornece uma medida da precisão do tamanho do efeito combinado. Valores menores indicam estimativas mais precisas.

  3. Valor p (p.value):

    • Indica a significância estatística do tamanho do efeito combinado.

    • Valores p baixos (geralmente < 0.05) sugerem que a diferença na expressão gênica é estatisticamente significativa.

  4. Valor p Ajustado (p.adj):

    • Corrige os valores p para múltiplos testes, reduzindo a chance de falsos positivos.

    • Genes com valores p.adj abaixo de um limiar (geralmente 0.05) são considerados diferencialmente expressos de forma significativa em múltiplos estudos.

Exemplo de Interpretação

Suponha que o resultado da meta-análise para um gene específico seja:

Gene EffectSize StdErr p.value p.adj

Gene1 1.2 0.3 0.001 0.01

  • Gene: Gene1

  • EffectSize: 1.2

    • Gene1 é mais expresso nos casos do que nos controles.

  • StdErr: 0.3

    • A precisão da estimativa do tamanho do efeito é razoável.

  • p.value: 0.001

    • A diferença na expressão é estatisticamente significativa.

  • p.adj: 0.01

    • Mesmo após correção para múltiplos testes, a diferença na expressão de Gene1 entre casos e controles permanece estatisticamente significativa.

Conclusão

Interpretar os resultados da meta-análise ajuda a identificar genes que são consistentemente diferencialmente expressos entre casos e controles através de múltiplos estudos. Esses genes podem ser candidatos para estudos adicionais, validação experimental ou como biomarcadores potenciais para a condição estudada.