siRNA biod. Intraventricular intracranial injection
Verlov_NA
2023-12-13
1 Описание эксперимента
1.1 Объект исследования
Что за siRNA
1.2 Экспериментальные группы
Исследование проводили на аутбредных мышах ICR (CD-1) SPF-категории, самках с исходной массой тела 27–32 г. Животные находились в условиях конвенционального вивария в вентилируемом помещении с автоматизированной системой регулирования светового режима: 12 часов день и 12 часов ночь, при температуре 22–24°С. Мышей содержали по 3 или 5 особей в стандартных клетках, в которых мыши имели свободный доступ к брикетированному корму и воде питьевого качества. Для опытов отбирали только клинически здоровых животных. Случайным выбором из равнозначных по массе животных сформировали три группы:
1. Контроль, внутрижелудочковое интракраниальное однократное введение Na125I (о.в. 5 мкл) \(I-125\)
2. siRNA, внутрижелудочковое интракраниальное однократное введение препарата siRNA, меченной 125I (о.в. 5 мкл) \(siRNA\)
3. LNP siRNA, внутрижелудочковое интракраниальное однократное введение препарата siRNA, меченной 125I, упаковннной в липидные наночастицы (о.в. 5 мкл) \(LNP + siRNA\)
Животных в каждой из исследованных групп выводили из эксперимента в контрольных точках (30 минут и 12, 24, 72 часа) и производили взятие биологического материала (кровь, головной мозг, сердце, лёгкие, печень, почки, селезенка, мочевой пузырь, щитовидная железа). Для каждого образца измеряли массу и накопленную в нем дозу (в гамма-виалах на жидкостном сцинтилляционном альфа-бета радиометре TRI-CARB 5110 TR, PerkinElmer).
1.3 Материалы и методы
Процедура йодирования siRNA
Процедура введения препарата
и пр.
2 Результаты
2.1 Описательная статистика распределения в органах и тканях
Данные, полученные в результате измерения массы и накопленой дозы в образцах органов и тканей экспериментальных животных приведены в Таблице 1.
| Characteristic | I-125 | siRNA | LNP + siRNA | ||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| N0 Кровь1 | N1 Головной мозг1 | N2 Сердце1 | N3 Легкие1 | N4 Печень1 | N5 Почки1 | N6 Селезенка1 | N7 Мочевой пузырь1 | N8 Щитовижная железа1 | N0 Кровь1 | N1 Головной мозг1 | N2 Сердце1 | N3 Легкие1 | N4 Печень1 | N5 Почки1 | N6 Селезенка1 | N7 Мочевой пузырь1 | N8 Щитовижная железа1 | N0 Кровь1 | N1 Головной мозг1 | N2 Сердце1 | N3 Легкие1 | N4 Печень1 | N5 Почки1 | N6 Селезенка1 | N7 Мочевой пузырь1 | N8 Щитовижная железа1 | |
| Time | |||||||||||||||||||||||||||
| 30 min | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) |
| 12h | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 3 (50%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) |
| 24h | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 4 (21%) | 4 (21%) | 4 (21%) | 4 (21%) | 4 (21%) | 4 (21%) | 4 (21%) | 4 (21%) | 4 (21%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) | 5 (28%) |
| 72h | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 5 (26%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) | 4 (22%) |
| Mass | 309 (280, 336) | 350 (350, 350) | 198 (175, 213) | 556 (360, 722) | 1,003 (763, 1,299) | 528 (467, 560) | 167 (155, 222) | 29 (15, 34) | 46 (39, 61) | 373 (269, 439) | 350 (350, 350) | 190 (149, 217) | 398 (300, 467) | 1,093 (721, 1,470) | 477 (433, 533) | 196 (178, 234) | 42 (28, 54) | 67 (48, 89) | 308 (269, 395) | 350 (350, 350) | 199 (179, 231) | 404 (339, 596) | 1,182 (882, 1,492) | 521 (416, 567) | 150 (124, 208) | 46 (41, 68) | 69 (38, 114) |
| Dose | 1,941 (775, 2,384) | 385 (304, 575) | 86 (64, 122) | 190 (138, 274) | 789 (416, 1,222) | 548 (275, 1,284) | 302 (160, 421) | 150 (123, 405) | 101 (72, 126) | 742 (258, 8,098) | 3,678 (1,674, 196,871) | 84 (63, 427) | 190 (88, 953) | 1,003 (339, 4,628) | 458 (221, 5,154) | 129 (77, 1,044) | 98 (62, 2,025) | 79 (57, 191) | 259 (136, 3,391) | 7,366 (3,851, 76,273) | 57 (41, 281) | 103 (83, 695) | 1,304 (932, 5,960) | 237 (188, 2,742) | 206 (118, 467) | 100 (54, 521) | 64 (54, 158) |
| 1 n (%); Median (IQR) | |||||||||||||||||||||||||||
Произведем расчёт дозы, накопленной в органе, относительно введенной дозы по формуле \(Dose_{relOrgan} = Dose_{Organ} / Dose_{Injected}\), где \(Dose_{Injected}\) - доза введенная животному (расчитывается, как отношение образца дозы введения и активности зарегистрированной в животном непосредственно после окончания введения). Данные о распределении введённого препарата представлены на Рисунке 2.1.
Figure 2.1: Распределение препаратов свободного йода (I-125), свободной siRNA, меченной радиоактивным йодом, (siRNA) и siRNA, упакованной в липидные наночастицы, (LNP + siRNA) при интракраниальном внутрижелудочковом введении
Доступность препаратов к головному мозгу (от введенной дозы, %ID) приведена на Рисунке 2.2. Можно отметить, что через 12 часов после введения препарата свободного йода (интракраниально) доза не регистрируется в образце органа, что хорошо согласуется с отсутсвием ожиданий относительно специфического накопления препарата и его быстрым выведением из организма животного, преимущественно с мочой. Данные распределения активности в других органах, в т.ч. мочевом пузыре, и доза зарегистрированная в подстиле клетки, где содержались животные после введения препарата, подтверждает наш вывод.
Figure 2.2: Распределение препаратов свободного йода (I-125), свободной siRNA, меченной радиоактивным йодом, (siRNA) и siRNA, упакованной в липидные наночастицы, (LNP + siRNA) при интракраниальном внутрижелудочковом введении в головном мозге (кроме точки выведения 30 минут)
2.2 Статистика вывода, для полученных данных
Сравнение динамики уменьшения содержания препаратов \(siRNA\) и \(LNP + siRNA\) показывает, что образцец упакованной в липидные наночастицы РНК лучше накапливается/медленнее выводится из головного мозга, сохраняя относительно высокую концентрацию (примерно 1% от введенной дозы) даже спустя 72 часа после введения, когда конценртация препарата в прочих органах и тканях сравнима с фоновым значением регистрируемой прибором дозы. Сравнивая дозу в организме животного и дозу в головном мозге, можно говорить о том, что больше 90% от дозы накоплено в головном мозге. Основной путь выведения препаратов \(siRNA\) и \(LNP + siRNA\), также как и свободного йода - экскреция с мочой. Накопление препарата \(LNP + siRNA\) в головном мозге носит достоверный характер, как в случае сравнения со свободным йодом, так и в случае \(siRNA\) (см. Рисунок 2.3).
Figure 2.3: Распределение препаратов свободной siRNA, меченной радиоактивным йодом, (siRNA) и siRNA, упакованной в липидные наночастицы, (LNP + siRNA) при интракраниальном внутрижелудочковом введении в головном мозге (кроме точки 30 минут)
Для проверки совпадения в статистической достоверности в точках 12, 24 и 72 часа приведу описательную статистику для полученных данных (см. Таблицу ??). Из таблицы видно, что ошибки нет и тест Манна-Уитни дает одинаковые уровни статистической значимости (p = 0.016) для точек 12, 24 и 72 часа, что связанно с тем, что у нас не очень большая выборка и сравнимые по величине эффекты (см. Critical Values for the Mann — Whitney U-Test).
| Characteristic | 30 min | 12h | 24h | 72h | ||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| I-1251 | siRNA1 | LNP + siRNA1 | p-value2 | I-1251 | siRNA1 | LNP + siRNA1 | p-value2 | I-1251 | siRNA1 | LNP + siRNA1 | p-value2 | I-1251 | siRNA1 | LNP + siRNA1 | p-value2 | |
| RelDose_Proc | NA (NA, NA) | 58 (53, 58) | 32 (31, 40) | 0.008 | NA (NA, NA) | 0.66 (0.42, 0.79) | 2.14 (1.70, 3.07) | 0.016 | NA (NA, NA) | 0.27 (0.22, 0.34) | 1.87 (1.10, 2.70) | 0.016 | NA (NA, NA) | 0.13 (0.13, 0.14) | 0.80 (0.57, 1.00) | 0.016 |
| 1 Median (IQR) | ||||||||||||||||
| 2 Wilcoxon rank sum exact test | ||||||||||||||||
Проведем расчёт дозы накопленной в грамме органа для каждого из препаратов по формуле \(Dose_{specOrgan} = Dose_{relOrgan} / Mass_{gr}\), результаты расчёта приведены на Рисунке 2.4). Профиль распределения после нормировки на массу органов и тканей остался прежним, можно отметить, что при выбранном режиме введения и препараты \(siRNA\) и \(LNP + siRNA\) демонстрируют склонность к накоплению в тканях головного мозга, при этом препарат \(LNP + siRNA\) характеризуется более выраженным накоплением/длительностью выведения, чем препарат \(siRNA\).
Figure 2.4: Удельная доза препаратов в ораганах в контрольных точках 30 минут, 12, 24 и 72 часа