创建 SeuratObject

通过 Read10X()

最普通直接的读取原始数据的方式。

全代码一览

library(Seurat)
library(SeuratObject)

# setwd()
options(Seurat.object.assay.version = "v5")


dir.10x <- "Data"
data <- Read10X(data.dir = dir.10x)
obj <- CreateSeuratObject(
  counts = data,
  project = "SingleCell"
)
saveRDS(obj, file = "example.rds")

代码解析

library(Seurat) 

Loading required package: SeuratObject

Loading required package: sp

The legacy packages maptools, rgdal, and rgeos, underpinning the sp package,
which was just loaded, will retire in October 2023.
Please refer to R-spatial evolution reports for details, especially
https://r-spatial.org/r/2023/05/15/evolution4.html.
It may be desirable to make the sf package available;
package maintainers should consider adding sf to Suggests:.
The sp package is now running under evolution status 2
     (status 2 uses the sf package in place of rgdal)

Attaching package: 'SeuratObject'

The following objects are masked from 'package:base':

    intersect, saveRDS

Loading Seurat v5 beta version 
To maintain compatibility with previous workflows, new Seurat objects will use the previous object structure by default
To use new Seurat v5 assays: Please run: options(Seurat.object.assay.version = 'v5')

library(SeuratObject)

这两行代码加载了Seurat包和SeuratObject包，它们都是处理单细胞测序数据的常用工具库。

options(Seurat.object.assay.version = "v5")

这里设置了Seurat对象的测定版本选项为”v5”，是新类型的对象，能够兼容新版本Seurat的功能。

dir.10x <- "D:/Book/T2DM/Data/example/"

这一行设置了存放10x测序数据的目录路径为”Data/“。这个目录应该包含了matrix.mtx文件、genes.tsv或者features.tsv文件，以及barcodes.tsv文件（压缩形式的），这是 10x Genomics 数据的标准格式。

data <- Read10X(data.dir = dir.10x)
obj <- CreateSeuratObject(
  counts = data,
  project = "SingleCell"
)
obj

An object of class Seurat 
33538 features across 10030 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (33538 features, 0 variable features)
 1 layer present: counts

使用Read10X函数读取指定目录下的10x数据集。这个函数是Seurat包的一部分，专门用于读取 10x Genomics 单细胞数据，它会自动识别并读取包含基因表达矩阵、特征（基因）列表和条码列表的文件。读取的数据会被存储在data变量中。

这里使用CreateSeuratObject函数，将前面读取的数据data作为输入，创建一个Seurat对象obj。同时，将项目名称设置为”SingleCell”。Seurat对象是一个容器，包含了单细胞数据集及其相关的分析和元数据。

saveRDS(obj, file = "example.rds")

最后一行使用saveRDS函数将创建的Seurat对象obj保存到一个 RDS 文件中。RDS 格式是 R 语言特有的数据格式，用于存储 R 中的对象，这样可以在未来的会话中重新加载和使用。文件被保存为”example.rds”（要善于保存分析中的数据！）。

通过逐个读取方法

该方法主要应对一些Read10X()无法读出的原始数据格式。

全代码一览

library(Seurat)
library(SeuratObject)

# setwd()
options(Seurat.object.assay.version = "v5")


dir.10x <- "./Data/"
genes <- read.table(paste0(dir.10x, "genes.tsv"), stringsAsFactors = F, header = F)$V2
genes <- make.unique(genes, sep = ".")
barcodes <- readLines(paste0(dir.10x, "barcodes.tsv"))
mtx <- Matrix::readMM(paste0(dir.10x, "matrix.mtx"))
mtx <- as(mtx, "dgCMatrix")
colnames(mtx) <- barcodes
rownames(mtx) <- genes
obj <- CreateSeuratObject(
  counts = mtx,
  project = "SingleCell"
)

代码解析

library(Seurat)
library(SeuratObject)

这两行代码加载了Seurat包和SeuratObject包，它们都是处理单细胞测序数据的常用工具库。

options(Seurat.object.assay.version = "v5")

这里设置了Seurat对象的测定版本选项为”v5”，是新类型的对象，能够兼容新版本Seurat的功能。

dir.10x <- "D:/Book/T2DM/Data/example/"

定义了10x基因组数据所在的目录路径，预期该目录包含了单细胞测序数据。

genes <- read.table(paste0(dir.10x, "genes.tsv"), stringsAsFactors = F, header = F)$V2
genes <- make.unique(genes, sep = ".")

这两行代码读取了基因名称的文件（genes.tsv），通常是一个每行一个基因 ID 的文本文件。make.unique 函数确保所有的基因名称是唯一的，如果有重复，会通过增加后缀来区分。

barcodes <- readLines(paste0(dir.10x, "barcodes.tsv"))

读取了包含样本条码的文件（barcodes.tsv），这些条码通常对应于单细胞测序实验中的每个细胞。

mtx <- Matrix::readMM(paste0(dir.10x, "matrix.mtx"))
mtx <- as(mtx, "dgCMatrix")

'as(<dgTMatrix>, "dgCMatrix")' is deprecated.
Use 'as(., "CsparseMatrix")' instead.
See help("Deprecated") and help("Matrix-deprecated").

加载了一个稀疏矩阵（matrix.mtx），这个矩阵包含了基因表达的计数数据。Matrix::readMM 用于读取这种格式的文件，然后转换为dgCMatrix（一个用于稀疏矩阵的 R 类），以便于 Seurat 处理。

colnames(mtx) <- barcodes
rownames(mtx) <- genes

这两行代码分别设置了稀疏矩阵的列名和行名，分别对应于细胞的 barcodes 和基因 ID。

obj <- CreateSeuratObject(
  counts = mtx,
  project = "SingleCell"
)
obj

An object of class Seurat 
33538 features across 10030 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (33538 features, 0 variable features)
 1 layer present: counts

使用CreateSeuratObject函数创建了一个Seurat对象obj，以包含计数矩阵mtx。该对象用于后续的数据分析和可视化，并为这个Seurat对象指定了一个项目名称 "SingleCell"。

读取其他形式的原始数据

如果数据只是一个 txt 或者 csv 格式的文件，那么意味着这个文件就是处理好的表达矩阵（包含了barcode 以及 genes 的矩阵）。

全代码一览

library(Seurat)
library(SeuratObject)
library(data.table)
library(Matrix)

options(stringsAsFactors = FALSE)


# rawcount <- read.csv("Data.csv", sep=",")
rawcount <- read.table("Data.txt")
rawcount <- tibble::column_to_rownames(rawcount, "X")
rawcountd <- Matrix::Matrix(as.matrix(rawcount), sparse = T)
obj <- CreateSeuratObject(
  counts = rawcountd,
  project = "SingleCell"
)

代码解析

options(stringsAsFactors = FALSE)

这行命令设置了一个全局选项，使得在数据读取时，默认不会将字符串转换为因子（factor）类型。在R中，字符串默认有时会被转换为因子，这在某些数据分析场景下可能不是所需的行为。

rawcount <- read.table("D:/Book/T2DM/Data/example/Data.txt")

这行命令读取了名为”Data.txt”的文本文件，文件中包含了处理好的表达矩阵。

# rawcount <- tibble::column_to_rownames(rawcount, "X")
rawcountd <- Matrix::Matrix(as.matrix(rawcount), sparse = T)

这里使用tibble包中的column_to_rownames函数，将名为”X”的列设置为rawcount数据框的行名。通常，“X”列包含基因或其他特征的名称（这一步是非必要的，假如有的数据读取以后基因包含了 rowname）。

将rawcount数据框转换为矩阵，并进一步转换为稀疏矩阵格式（dgCMatrix），这是为了提高效率和减少存储空间。稀疏矩阵在单细胞数据分析中非常常见，因为细胞中大部分基因都没有表达，导致数据矩阵中有很多零。

obj <- CreateSeuratObject(
  counts = rawcountd,
  project = "SingleCell"
)
obj

An object of class Seurat 
18143 features across 6713 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (18143 features, 0 variable features)
 1 layer present: counts

使用CreateSeuratObject函数创建了一个 Seurat 对象obj，输入是表达矩阵数据rawcount。同时，指定了项目名称为”SingleCell”。

通过已经预处理好的文件来创建 SeuratObject，并添加 metadata

• 数据集：GSE218316，一个关于胰岛细胞的数据集。

• 三个预处理好的 10x 文件，一个记录了 meta.data 的文件

  • GSE218316_filtered_counts_barcodes.tsv.gz

  • GSE218316_filtered_counts_data.mtx.gz

  • GSE218316_filtered_counts_gene.tsv.gz

  • GSE218316_metadata_percell.csv.gz

前三份文件是作者过滤过的SeuratObject导出，最后一份文件提供了metadata，方便我们创建自己的SeuratObject时添加注释。

解决方案

处理文件

将上述头三个文件解压重命名为barcodes.tsv, matrix.mtx, genes.tsv，我把这三个文件放在了工作路径下的Data文件夹里。

解压GSE218316_metadata_percell.csv.gz，得到 GSE218316_metadata_percell.csv。

其中barcodes与矩阵文件都是和我们在前文中读取的格式一致，唯独genes.tsv和以往的features.tsv不同。我们可以看看差异：

# 读取 GSE218316 的基因文件
gene <- read.table("D:/Book/T2DM/Data/10x/genes.tsv")$V1
head(gene)

[1] "REG3A"  "CXCL10" "CTRB2"  "PRSS2"  "REG1A"  "SPINK1"

length(gene)

[1] 2000

# 随便挑一个原始的常规基因文件读取
gene <- read.table("D:/Book/T2DM/Data/10x/feature.tsv")$V2
head(gene)

[1] "MIR1302-2HG" "FAM138A"     "OR4F5"       "AL627309.1"  "AL627309.3" 
[6] "AL627309.2" 

length(gene)

[1] 33540

不难发现处理过的基因文件只剩下了2000个genesymbol。由于格式不同，我们不可以用read_10x()函数来读取。且由于基因个数不是常规的基因数（下文讨论），无法将其合并到处理好的表达矩阵中。在这里我们可以替换成该数据集的原始基因文件（由于几个样本的平台相同，因此随便选一个基因文件作为输入即可）。

# 常规情况下，读取第二栏获取 genesymbol
dir.10x <- "D:/Book/T2DM/Data/10x/"
genes <- read.table(paste0(dir.10x, "feature.tsv"), stringsAsFactors = F, header = F)$V2
head(genes)

[1] "MIR1302-2HG" "FAM138A"     "OR4F5"       "AL627309.1"  "AL627309.3" 
[6] "AL627309.2" 

# 此时只要读取第一栏
genes <- read.table(paste0(dir.10x, "genes.tsv"), stringsAsFactors = F, header = F)$V1
head(genes)

[1] "REG3A"  "CXCL10" "CTRB2"  "PRSS2"  "REG1A"  "SPINK1"

创建 SeuratObject

现在需要处理 metadata 文件。

# 导入 metadata
meta <- read.csv("D:/Book/T2DM/Data/GSE218316_metadata_percell.csv",header = T )
head(meta)

                    X         Condition Donor Timepoint seurat_clusters
1 B1_AAACCTGAGACTAAGT Glucose+Palmitate    D1       24h              23
2 B1_AAACCTGAGCAGGCTA Glucose+Palmitate    D1       24h              16
3 B1_AAACGGGGTTTCGCTC Glucose+Palmitate    D1       24h               7
4 B1_AAAGATGCACATAACC Glucose+Palmitate    D1       24h              28
5 B1_AAAGATGCACCTTGTC Glucose+Palmitate    D1       24h              20
6 B1_AAAGATGTCGTCTGCT Glucose+Palmitate    D1       24h              23
    CTclass Celltype
1  Exocrine     Duct
2  Exocrine     Duct
3 Endocrine     Beta
4  Exocrine     Duct
5 Endocrine    Alpha
6  Exocrine     Duct

我们在CreateSeuratObject()函数中的meta.data参数中导入meta变量即可。我在下面使用了分布读取的方法，这里直接用 read_10x() 也是可以的。

library(Seurat)
library(SeuratObject)

dir.10x <- "D:/Book/T2DM/Data/10x/"

# 这里 features.tsv.gz 替换成原始的基因文件，在这里我把文件解压为 feature.tsv
## read_10x()
genes <- read.table(paste0(dir.10x, "feature.tsv"), stringsAsFactors = F, header = F)$V2
genes <- make.unique(genes, sep = ".")
barcodes <- readLines(paste0(dir.10x, "barcodes.tsv"))
mtx <- Matrix::readMM(paste0(dir.10x, "matrix.mtx"))
mtx <- as(mtx, "dgCMatrix")
colnames(mtx) <- barcodes
rownames(mtx) <- genes
obj <- CreateSeuratObject(
  counts = mtx,
  # 传入 meta.data
  meta.data = meta,
  project = "Pancreatic islet cells"
)

查看新创建的SeuratObject：

obj

An object of class Seurat 
33540 features across 23845 samples within 1 assay 
Active assay: RNA (33540 features, 0 variable features)
 1 layer present: counts

head(obj@meta.data)

                    orig.ident                   X         Condition Donor
B1_AAACCTGAGACTAAGT         B1 B1_AAACCTGAGACTAAGT Glucose+Palmitate    D1
B1_AAACCTGAGCAGGCTA         B1 B1_AAACCTGAGCAGGCTA Glucose+Palmitate    D1
B1_AAACGGGGTTTCGCTC         B1 B1_AAACGGGGTTTCGCTC Glucose+Palmitate    D1
B1_AAAGATGCACATAACC         B1 B1_AAAGATGCACATAACC Glucose+Palmitate    D1
B1_AAAGATGCACCTTGTC         B1 B1_AAAGATGCACCTTGTC Glucose+Palmitate    D1
B1_AAAGATGTCGTCTGCT         B1 B1_AAAGATGTCGTCTGCT Glucose+Palmitate    D1
                    Timepoint seurat_clusters   CTclass Celltype nCount_RNA
B1_AAACCTGAGACTAAGT       24h              23  Exocrine     Duct       6161
B1_AAACCTGAGCAGGCTA       24h              16  Exocrine     Duct      11882
B1_AAACGGGGTTTCGCTC       24h               7 Endocrine     Beta      23081
B1_AAAGATGCACATAACC       24h              28  Exocrine     Duct       4864
B1_AAAGATGCACCTTGTC       24h              20 Endocrine    Alpha      10304
B1_AAAGATGTCGTCTGCT       24h              23  Exocrine     Duct       9934
                    nFeature_RNA
B1_AAACCTGAGACTAAGT         2103
B1_AAACCTGAGCAGGCTA         2760
B1_AAACGGGGTTTCGCTC         3569
B1_AAAGATGCACATAACC         1544
B1_AAAGATGCACCTTGTC         1630
B1_AAAGATGTCGTCTGCT         2399

讨论

需要注意各个变量中长度的对齐。

mtx 为 33540 x 23845 的矩阵。其中基因 33540 个，细胞 23845 个。

head(mtx)

6 x 23845 sparse Matrix of class "dgCMatrix"

  [[ suppressing 34 column names 'B1_AAACCTGAGACTAAGT', 'B1_AAACCTGAGCAGGCTA', 'B1_AAACGGGGTTTCGCTC' ... ]]

                                                                               
MIR1302-2HG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
FAM138A     . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
OR4F5       . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AL627309.1  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AL627309.3  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
AL627309.2  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
                  
MIR1302-2HG ......
FAM138A     ......
OR4F5       ......
AL627309.1  ......
AL627309.3  ......
AL627309.2  ......

 .....suppressing 23811 columns in show(); maybe adjust 'options(max.print= *, width = *)'
 ..............................

dim(mtx)

[1] 33540 23845

我们在传入基因和 metadata 的时候，需要保证他们的数量与 mtx 是一致的。

length(genes)

[1] 33540

dim(meta)

[1] 23845     7

dim(mtx)

[1] 33540 23845

工作环境

devtools::session_info()

─ Session info ───────────────────────────────────────────────────────────────
 setting  value
 version  R version 4.3.1 (2023-06-16 ucrt)
 os       Windows 11 x64 (build 22621)
 system   x86_64, mingw32
 ui       RTerm
 language (EN)
 collate  Chinese (Simplified)_China.utf8
 ctype    Chinese (Simplified)_China.utf8
 tz       Asia/Hong_Kong
 date     2023-11-08
 pandoc   3.1.9 @ C:/Users/HANWAN~1/AppData/Local/Pandoc/ (via rmarkdown)

─ Packages ───────────────────────────────────────────────────────────────────
 package          * version    date (UTC) lib source
 abind              1.4-5      2016-07-21 [1] CRAN (R 4.3.0)
 cachem             1.0.8      2023-05-01 [1] CRAN (R 4.3.1)
 callr              3.7.3      2022-11-02 [1] CRAN (R 4.3.1)
 cli                3.6.1      2023-03-23 [1] CRAN (R 4.3.1)
 cluster            2.1.4      2022-08-22 [2] CRAN (R 4.3.1)
 codetools          0.2-19     2023-02-01 [2] CRAN (R 4.3.1)
 colorspace         2.1-0      2023-01-23 [1] CRAN (R 4.3.1)
 cowplot            1.1.1      2020-12-30 [1] CRAN (R 4.3.1)
 crayon             1.5.2      2022-09-29 [1] CRAN (R 4.3.1)
 data.table         1.14.8     2023-02-17 [1] CRAN (R 4.3.2)
 deldir             1.0-9      2023-05-17 [1] CRAN (R 4.3.0)
 devtools           2.4.5      2022-10-11 [1] CRAN (R 4.3.2)
 digest             0.6.33     2023-07-07 [1] CRAN (R 4.3.1)
 dotCall64          1.0-2      2022-10-03 [1] CRAN (R 4.3.1)
 dplyr              1.1.3      2023-09-03 [1] CRAN (R 4.3.2)
 ellipsis           0.3.2      2021-04-29 [1] CRAN (R 4.3.1)
 evaluate           0.21       2023-05-05 [1] CRAN (R 4.3.1)
 fansi              1.0.4      2023-01-22 [1] CRAN (R 4.3.1)
 fastDummies        1.7.3      2023-07-06 [1] CRAN (R 4.3.1)
 fastmap            1.1.1      2023-02-24 [1] CRAN (R 4.3.1)
 fitdistrplus       1.1-11     2023-04-25 [1] CRAN (R 4.3.1)
 fs                 1.6.3      2023-07-20 [1] CRAN (R 4.3.1)
 future             1.33.0     2023-07-01 [1] CRAN (R 4.3.1)
 future.apply       1.11.0     2023-05-21 [1] CRAN (R 4.3.1)
 generics           0.1.3      2022-07-05 [1] CRAN (R 4.3.1)
 ggplot2            3.4.4      2023-10-12 [1] CRAN (R 4.3.2)
 ggrepel            0.9.3      2023-02-03 [1] CRAN (R 4.3.1)
 ggridges           0.5.4      2022-09-26 [1] CRAN (R 4.3.1)
 globals            0.16.2     2022-11-21 [1] CRAN (R 4.3.0)
 glue               1.6.2      2022-02-24 [1] CRAN (R 4.3.1)
 goftest            1.2-3      2021-10-07 [1] CRAN (R 4.3.0)
 gridExtra          2.3        2017-09-09 [1] CRAN (R 4.3.1)
 gtable             0.3.3      2023-03-21 [1] CRAN (R 4.3.1)
 htmltools          0.5.5      2023-03-23 [1] CRAN (R 4.3.1)
 htmlwidgets        1.6.2      2023-03-17 [1] CRAN (R 4.3.1)
 httpuv             1.6.11     2023-05-11 [1] CRAN (R 4.3.1)
 httr               1.4.6      2023-05-08 [1] CRAN (R 4.3.1)
 ica                1.0-3      2022-07-08 [1] CRAN (R 4.3.0)
 igraph             1.5.0      2023-06-16 [1] CRAN (R 4.3.1)
 irlba              2.3.5.1    2022-10-03 [1] CRAN (R 4.3.1)
 jsonlite           1.8.7      2023-06-29 [1] CRAN (R 4.3.1)
 KernSmooth         2.23-21    2023-05-03 [2] CRAN (R 4.3.1)
 knitr              1.43       2023-05-25 [1] CRAN (R 4.3.1)
 later              1.3.1      2023-05-02 [1] CRAN (R 4.3.1)
 lattice            0.21-8     2023-04-05 [2] CRAN (R 4.3.1)
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 zoo                1.8-12     2023-04-13 [1] CRAN (R 4.3.1)

 [1] C:/Users/Han Wang/AppData/Local/R/win-library/4.3
 [2] C:/Program Files/R/R-4.3.1/library

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