Code
library(tidyverse)
library(RColorBrewer)
library(pheatmap)
library(factoextra)
library(kableExtra)
library(plotly)
library(DESeq2)
library(PoiClaClu)
library(vsn)
library(Glimma)
library(EnhancedVolcano)
library(hexbin)Expresión diferencial RNA-seq: G1E-MK
Este documento se creó con los datos generados y editados por el Dr. Carlos Yebra y es un complemento del Tutorial de Análisis de Expresión Diferencial en Galaxy de la Dra. Alejandra Rougon Cardozo, para llevar a cabo el DESeq con R.
También está basado en:
Analyzing RNA-seq data with DESeq2 de Michael I. Love, Simon Anders y Wolfgang Huber.
RNA-seq workflow: gene-level exploratory analysis and differential expression de Michael I.Love, Simon Anders, Vladislav Kim y Wolfgang Huber.
Panorama general de análisis de datos de RNA-seq con R de la Red Mexicana de Bioinformática.
Expresión diferencial RNA-seq: G1E-MK
El análisis de expresión diferencial es un método para identificar genes cuya expresión varía significativamente en diferentes grupos de muestras. El método compara los niveles de expresión de genes en diferentes condiciones y determina qué genes están sobreexpresados o subexpresados en cada condición. El G1E es una línea celular que deriva de células madre embrionarias de ratón, son parte de la diferenciación eritroide y se usan como modelo de estudio (Weiss et al. 1997). Los megacariocitos son células precursoras de las plaquetas. Se localizan en la médula ósea y son responsables de la producción y liberación de plaquetas al torrente sanguíneo. Los megacariocitos tienen un papel fundamental en la hemostasia y la coagulación sanguínea, ya que las plaquetas son esenciales para la formación de coágulos sanguíneos y la reparación de vasos sanguíneos dañados (Italiano y Shivdasani 2003; González-Villalva et al. 2019).
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Importar datos
Code
# Se leen los archivos
G1E_rep1 <- read.table("./data/G1E_rep1.tabular", header = TRUE, sep="\t")
G1E_rep2 <- read.table("./data/G1E_rep2.tabular", header = TRUE, sep="\t")
MK_rep1 <- read.table("./data/MK_rep1.tabular", header = TRUE, sep="\t")
MK_rep2 <- read.table("./data/MK_rep2.tabular", header = TRUE, sep="\t")
# Se unen con left_join
countdata_df <- left_join(G1E_rep1, G1E_rep2) |> left_join(MK_rep1) |>
left_join(MK_rep2)
# Se transforma en una matriz
countdata <- as.matrix(dplyr::select(countdata_df, -Geneid))
row.names(countdata) <- countdata_df$Geneid
# Es necesario que la columna que contiene los nombres de las muestras se llame "names"
coldata <- data.frame(names = factor(colnames(countdata)),
cell = factor(c("G1E", "G1E", "MK", "MK")))
row.names(coldata) <- coldata$namesMatriz de conteos
Se muestra la matriz de conteos.
Por lo que entendí, una matriz de conteos es una tabla donde se muestran los recuentos de expresión génica para cada gen. Los recuentos pueden ser el número de lecturas de secuenciación que se alinean a dicho gen o el número de fragmentos de secuencias.
Code
kable(countdata, align = "c") %>% kable_styling(c("striped", "hover"), full_width = F)%>% scroll_box(width="100%", height="300px", fixed_thead = TRUE)| G1E_rep1 | G1E_rep2 | MK_rep1 | MK_rep2 | |
|---|---|---|---|---|
| NM_001024952 | 9 | 8 | 0 | 1 |
| NM_080844 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.7.1 | 7 | 22 | 27 | 0 |
| MSTRG.8.1 | 8 | 10 | 40 | 0 |
| MSTRG.1.1 | 10 | 8 | 4 | 0 |
| MSTRG.9.1 | 18 | 6 | 0 | 0 |
| MSTRG.26.1 | 4 | 51 | 0 | 0 |
| MSTRG.27.1 | 18 | 41 | 5 | 0 |
| NR_002840 | 9 | 22 | 15 | 0 |
| NR_028543 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.20.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.20.1 | 6 | 11 | 0 | 0 |
| NR_131029 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_131030 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_131028 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001159930 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.22.1 | 112 | 334 | 119 | 3 |
| MSTRG.23.1 | 245 | 400 | 119 | 0 |
| MSTRG.31.1 | 19 | 15 | 0 | 0 |
| MSTRG.32.1 | 213 | 291 | 48 | 5 |
| MSTRG.32.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.33.1 | 70 | 139 | 15 | 0 |
| MSTRG.34.1 | 61 | 101 | 79 | 1 |
| NM_173424 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.28.1 | 1 | 3 | 0 | 0 |
| MSTRG.28.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.28.3 | 0 | 5 | 0 | 0 |
| NM_172644 | 4 | 5 | 0 | 0 |
| MSTRG.3.1 | 671 | 939 | 173 | 3 |
| MSTRG.4.1 | 3 | 7 | 0 | 0 |
| MSTRG.5.1 | 3 | 18 | 14 | 0 |
| NM_001039482 | 4 | 1 | 10 | 0 |
| MSTRG.24.1 | 0 | 0 | 0 | 7 |
| NM_199028 | 7 | 2 | 1 | 0 |
| MSTRG.11.1 | 375 | 607 | 531 | 6 |
| NM_009846 | 87 | 126 | 0 | 0 |
| NR_033558 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.14.1 | 105 | 154 | 29 | 1 |
| MSTRG.14.2 | 1405 | 1564 | 210 | 1 |
| MSTRG.16.1 | 225 | 286 | 45 | 0 |
| MSTRG.17.1 | 166 | 182 | 265 | 5 |
| MSTRG.18.1 | 111 | 126 | 55 | 0 |
| MSTRG.6.1 | 104 | 56 | 119 | 18 |
| NM_026411 | 2 | 0 | 16 | 0 |
| MSTRG.12.1 | 22681 | 31970 | 79 | 6 |
| MSTRG.37.1 | 2 | 13 | 0 | 0 |
| MSTRG.39.1 | 269 | 490 | 3 | 0 |
| NM_030093 | 5 | 1 | 0 | 2 |
| MSTRG.41.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.41.1 | 2 | 1 | 9 | 0 |
| MSTRG.41.3 | 0 | 1 | 1 | 0 |
| MSTRG.42.1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
| MSTRG.42.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.43.1 | 0 | 0 | 8 | 0 |
| MSTRG.43.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_010822 | 2 | 14 | 3 | 0 |
| MSTRG.46.1 | 5053 | 6558 | 808 | 149 |
| NM_010405 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001083955 | 28 | 21 | 54 | 4 |
| NM_001033981 | 4 | 1 | 0 | 0 |
| NM_175000 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_177364 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_172799 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| MSTRG.47.1 | 19 | 17 | 0 | 0 |
| NM_008267 | 25 | 13 | 0 | 0 |
| MSTRG.59.3 | 61 | 113 | 0 | 0 |
| MSTRG.59.4 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.59.1 | 18 | 21 | 0 | 0 |
| MSTRG.59.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_108029 | 68 | 127 | 0 | 0 |
| NR_037977 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_029721 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_008270 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_010461 | 0 | 1 | 0 | 0 |
| NM_010460 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.62.1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.62.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.62.3 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| NM_008374 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001134458 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.36.1 | 1857 | 2110 | 1375 | 19 |
| NM_010117 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001291818 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.45.1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.45.2 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| NR_104306 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_181569 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001284360 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001284359 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.52.1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.52.5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.52.3 | 3 | 5 | 6 | 1 |
| MSTRG.52.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.52.4 | 273 | 417 | 165 | 64 |
| MSTRG.52.7 | 0 | 1 | 0 | 1 |
| MSTRG.52.6 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| NM_001271018 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.48.1 | 11092 | 14273 | 2 | 1 |
| MSTRG.50.1 | 71 | 98 | 0 | 0 |
| MSTRG.60.1 | 502 | 690 | 2 | 0 |
| MSTRG.55.1 | 171 | 186 | 2 | 0 |
| MSTRG.56.1 | 394 | 1195 | 567 | 22 |
| MSTRG.58.1 | 18 | 9 | 0 | 0 |
| NR_131758 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| MSTRG.63.1 | 6 | 13 | 0 | 0 |
| NM_001177354 | 77 | 50 | 16 | 7 |
| NR_003368 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_132747 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_132746 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.68.1 | 1 | 7 | 46 | 0 |
| MSTRG.69.1 | 5 | 11 | 132 | 2 |
| MSTRG.70.1 | 11 | 44 | 2 | 0 |
| MSTRG.71.1 | 99 | 205 | 279 | 3 |
| NM_010463 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001024842 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| NM_010462 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_029722 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.77.1 | 154 | 174 | 0 | 0 |
| NM_008272 | 9 | 8 | 0 | 0 |
| MSTRG.78.2 | 140 | 151 | 0 | 0 |
| NM_010466 | 17 | 10 | 0 | 0 |
| MSTRG.81.1 | 7 | 12 | 0 | 0 |
| NM_010465 | 24 | 55 | 0 | 0 |
| MSTRG.80.1 | 11 | 12 | 0 | 0 |
| NM_175730 | 20 | 19 | 0 | 0 |
| NR_030526 | 21 | 32 | 0 | 0 |
| MSTRG.89.1 | 6 | 17 | 0 | 0 |
| NM_013553 | 68 | 104 | 0 | 0 |
| MSTRG.92.1 | 39 | 97 | 17 | 0 |
| MSTRG.65.3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.65.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.65.1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.66.1 | 4 | 11 | 48 | 2 |
| NR_047528 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.73.1 | 8 | 20 | 5 | 0 |
| MSTRG.79.1 | 1793 | 1751 | 2 | 4 |
| MSTRG.74.1 | 1 | 7 | 0 | 0 |
| MSTRG.75.1 | 1516 | 1618 | 4 | 1 |
| MSTRG.82.2 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| MSTRG.82.1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.82.3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.82.5 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.82.4 | 5 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.82.6 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.87.1 | 1980 | 2517 | 0 | 0 |
| MSTRG.88.1 | 44 | 159 | 0 | 0 |
| MSTRG.90.1 | 21 | 66 | 0 | 0 |
| MSTRG.85.1 | 100 | 218 | 1 | 0 |
| MSTRG.84.1 | 82 | 99 | 0 | 0 |
| MSTRG.91.1 | 89 | 231 | 0 | 1 |
| MSTRG.95.1 | 758 | 963 | 1 | 1 |
| MSTRG.97.1 | 8 | 7 | 0 | 0 |
| MSTRG.97.2 | 217 | 284 | 0 | 0 |
| MSTRG.93.1 | 132 | 85 | 6 | 1 |
| NR_045743 | 0 | 4 | 0 | 0 |
| MSTRG.94.1 | 46 | 95 | 39 | 0 |
| NM_007757 | 634 | 495 | 17 | 2 |
| NM_171826 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001252451 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001252450 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_172469 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.108.1 | 142 | 246 | 1347 | 15 |
| MSTRG.110.1 | 249 | 199 | 659 | 49 |
| MSTRG.111.1 | 24 | 36 | 56 | 2 |
| MSTRG.112.1 | 41 | 98 | 41 | 2 |
| MSTRG.113.1 | 20066 | 23364 | 27300 | 3946 |
| MSTRG.104.1 | 1 | 0 | 170 | 21 |
| NM_001271687 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271690 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271692 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271694 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_019664 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271695 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271693 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271691 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271689 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001039057 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001039056 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.106.1 | 181 | 251 | 246 | 0 |
| MSTRG.107.1 | 9 | 23 | 40 | 1 |
| MSTRG.98.1 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| MSTRG.99.1 | 0 | 0 | 2 | 0 |
| NM_001033404 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| NM_175011 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.100.1 | 68667 | 77846 | 2722 | 86 |
| NM_001162955 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.103.1 | 226 | 358 | 80 | 8 |
| NM_147001 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_009821 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001111023 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001111022 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001111021 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001302154 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001302153 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_133659 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001302183 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001302179 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001302152 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.115.1 | 1 | 6 | 70 | 0 |
| NM_178652 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271631 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271630 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001145920 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_009820 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001271627 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001146038 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.116.1 | 445 | 449 | 236 | 6 |
| NM_029257 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| NM_010721 | 38 | 32 | 10 | 3 |
| MSTRG.122.1 | 31 | 40 | 19 | 0 |
| MSTRG.122.2 | 10 | 31 | 2 | 0 |
| MSTRG.124.1 | 305 | 247 | 42 | 6 |
| MSTRG.124.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.126.1 | 851 | 1401 | 208 | 15 |
| NM_177115 | 0 | 4 | 0 | 0 |
| MSTRG.119.1 | 27 | 58 | 39 | 1 |
| MSTRG.120.1 | 5 | 4 | 1 | 1 |
| MSTRG.123.1 | 2 | 22 | 2 | 0 |
| NM_008275 | 0 | 0 | 2 | 0 |
| NM_008274 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_073086 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| NM_008273 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_013554 | 0 | 0 | 0 | 1 |
| NM_013555 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.129.1 | 16 | 15 | 0 | 0 |
| MSTRG.129.2 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| NM_010468 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001290731 | 7 | 4 | 0 | 0 |
| NM_008276 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001290730 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_010469 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| NR_029566 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_110447 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_010467 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001077514 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_011393 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001077515 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.128.1 | 0 | 0 | 0 | 5 |
| MSTRG.137.1 | 229 | 467 | 1266 | 19 |
| MSTRG.138.1 | 396 | 729 | 750 | 25 |
| MSTRG.140.1 | 5 | 18 | 1 | 0 |
| MSTRG.139.1 | 3 | 5 | 4 | 1 |
| NM_007967 | 0 | 0 | 6 | 3 |
| NR_027899 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.131.2 | 13 | 11 | 0 | 0 |
| MSTRG.131.3 | 113 | 163 | 0 | 0 |
| MSTRG.134.1 | 987 | 952 | 0 | 0 |
| MSTRG.135.1 | 13 | 14 | 0 | 0 |
| NR_110445 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001177785 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001177787 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_009851 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001177786 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001039151 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001039150 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001111026 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001111027 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_009822 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.142.1 | 909 | 1635 | 552 | 1 |
| MSTRG.142.2 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.142.3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001304555 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_009185 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001304559 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001304553 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001304551 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_011527 | 14 | 18 | 26 | 11 |
| MSTRG.150.2 | 47 | 69 | 68 | 8 |
| NM_001287388 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.152.1 | 1 | 2 | 0 | 0 |
| NM_026018 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001164558 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001164557 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_131922 | 2 | 0 | 57 | 0 |
| NM_025647 | 17 | 36 | 14 | 0 |
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| MSTRG.356.9 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.356.11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.356.13 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.356.15 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.356.14 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_009767 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_009440 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_002844 | 1 | 7 | 145 | 0 |
| MSTRG.347.1 | 0 | 2 | 618 | 3 |
| MSTRG.348.1 | 0 | 0 | 52 | 0 |
| MSTRG.349.1 | 1 | 1 | 89 | 0 |
| MSTRG.350.1 | 0 | 2 | 155 | 10 |
| NR_015508 | 0 | 0 | 0 | 2 |
| NR_033398 | 4 | 0 | 0 | 0 |
| NR_037298 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.316.1 | 9047 | 11590 | 7512 | 644 |
| MSTRG.317.1 | 25 | 39 | 3 | 0 |
| MSTRG.318.3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.318.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.318.1 | 16 | 16 | 82 | 1 |
| MSTRG.320.1 | 25 | 27 | 286 | 13 |
| MSTRG.325.1 | 1121 | 1148 | 639 | 36 |
| MSTRG.325.2 | 55 | 93 | 88 | 2 |
| MSTRG.325.3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_019478 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001252528 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001252529 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.331.1 | 9107 | 11549 | 7682 | 576 |
| MSTRG.322.1 | 0 | 0 | 52 | 6 |
| MSTRG.323.1 | 0 | 0 | 83 | 9 |
| NM_181548 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_010413 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_001130416 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_008089 | 13 | 14 | 15 | 3 |
| MSTRG.341.1 | 20 | 39 | 19 | 1 |
| MSTRG.336.1 | 10 | 14 | 6 | 0 |
| NM_027227 | 0 | 2 | 0 | 0 |
| NM_001290716 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NM_011514 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.352.1 | 9 | 18 | 0 | 0 |
| NR_015505 | 9 | 8 | 0 | 0 |
| MSTRG.346.2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MSTRG.346.1 | 1 | 2 | 0 | 0 |
| NR_001570 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_001463 | 0 | 5 | 0 | 0 |
| MSTRG.344.1 | 29 | 95 | 0 | 0 |
| MSTRG.357.1 | 5 | 12 | 1 | 0 |
| MSTRG.361.1 | 17 | 7 | 79 | 5 |
| MSTRG.362.1 | 0 | 1 | 23 | 0 |
| MSTRG.358.1 | 0 | 0 | 33 | 0 |
| MSTRG.359.1 | 0 | 0 | 27 | 0 |
| NR_028381 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| NR_028380 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_030558 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NR_030418 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Información de la condición experimental
Code
kable(coldata, align = "c") %>% kable_styling(c("striped", "hover"), full_width = F)%>% scroll_box(width="50%", height="200px", fixed_thead = TRUE)| names | cell | |
|---|---|---|
| G1E_rep1 | G1E_rep1 | G1E |
| G1E_rep2 | G1E_rep2 | G1E |
| MK_rep1 | MK_rep1 | MK |
| MK_rep2 | MK_rep2 | MK |
DESeqDataSet
Con la matriz de conteos y la tabla con la información de la condición experimental (en este caso línea celular) se crea un objeto de la clase DESeqDataSet, el cual tiene una fórmula de diseño asociada. La formula de diseño indica qué columnas de la tabla de información de las muestras especifican el diseño experimental y cómo se deben utilizar estos factores en el análisis. Aquí se usa la formula design = ~ cell. A continuación se muestra la información del objeto generado.
Code
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countdata,
colData = coldata,
design = ~ cell)
dds$cell <- relevel(dds$cell, "MK")
ddsclass: DESeqDataSet
dim: 629 4
metadata(1): version
assays(1): counts
rownames(629): NM_001024952 NM_080844 ... NR_030558 NR_030418
rowData names(0):
colnames(4): G1E_rep1 G1E_rep2 MK_rep1 MK_rep2
colData names(2): names cellA partir de este objeto se puede acceder a la matriz de conteos por medio de las funciones counts(dds) o assay(dds); y a la tabla con la información de las muestras con colData(dds).
Filtro preliminar
Dado que en la matriz de conteos existen muchas filas que sólo contienen ceros, estas se eliminan.
# Número inicial de filas
nrow(dds)[1] 629keep <- rowSums(counts(dds))>1
dds <- dds[keep, ]
# Número de filas después del filtro
nrow(dds)[1] 359Normalización y transformaciones
La normalización en DESeq es crucial ya que los datos de cuentas crudas de RNA-seq pueden estar sujetos a variaciones técnicas y biológicas que pueden dificultar la comparación entre las muestras. La normalización tiene como objetivo corregir estas variaciones para que los datos sean más comparables y se puedan realizar análisis de expresión diferencial más confiables.
DESeq utiliza un enfoque llamado “normalización de factores de tamaño” para lograr esto. El proceso general de normalización en DESeq involucra los siguientes pasos:
1. Cálculo de factores de tamaño (size factor): Para cada muestra, se calcula un “factor de tamaño” que ajusta los conteos brutos para reflejar la cantidad total de lecturas secuenciadas en esa muestra en relación con la cantidad total de lecturas en todas las muestras. Los factores de tamaño son esenciales para tener en cuenta las diferencias en la profundidad de secuenciación entre las muestras. El factor de tamaño para la \(j\)-ésima columna (muestra) está dado por:
2. Aplicación de factores de tamaño: Se aplican los factores de tamaño a los datos de conteo de cada muestra, dividiendo las cuents crudas por el factor de tamaño correspondiente. Esto tiene el efecto de normalizar los datos para que sean comparables entre todas las muestras.
A menudo, después de la normalización, a los datos se les aplica alguna transformación para reducir la heterocedasticidad y hacer que los datos sean más adecuados para análisis estadísticos posteriores. DESeq2 cuenta con dos transformaciones para datos de conteo que estabilizan la varianza: variance stabilizing transformation (VST) y la regularized-logarithm transformation (rlog).
Gráfica de medias y desviación estándar, alta heterocedasticidad.
Code
meanSdPlot(counts(dds), ranks = FALSE)
A continuación se aplica la normalización a la matriz de cuentas crudas, además de aplicar las transformaciones VST y rlog (el diseño del experimento no contribuye a la tendencia esperada media-varianza). Para mostrar los efectos de las transformaciones se hace un scatterplot de las primeras dos muestras con los valores obtenidos.
Code
# Normalización
dds <- estimateSizeFactors(dds)
# variance stabilizing transformation (VST), la función vst() se utiliza para conjuntos con muchos datos, en esta caso utilizamos la siguiente función:
vsd <- varianceStabilizingTransformation(dds, blind = FALSE)
# regularized-log transformation (rlog)
rld <- rlog(dds, blind=FALSE)Code
# Juntar los datos de las tres normalizaciones
df <- bind_rows(
as_tibble(log2(counts(dds, normalized=TRUE)[, 1:2]+1)) %>%
mutate(transformation = "log2(x + 1)"),
as_tibble(assay(vsd)[, 1:2]) %>% mutate(transformation = "vst"),
as_tibble(assay(rld)[, 1:2]) %>% mutate(transformation = "rlog"))
# Renombrar columnas
colnames(df)[1:2] <- c("x", "y")
# Nombre de las graficas
lvls <- c("log2(x + 1)", "vst", "rlog")
# Agrupar los tres tipos de normalizacion en grupos como factores
df$transformation <- factor(df$transformation, levels=lvls)
# Plotear los datos
ggplot(df, aes(x = x, y = y)) +
geom_hex(bins = 80) +
coord_fixed() +
facet_grid( . ~ transformation)
Exploración de datos
Distancia entre las muestras
Inicialmente se evalúa la similitud general entre las muestras visualizando las matrices de distancias con la función pheatmat(). Al calcular la matriz de distancias es necesario brindar la matriz transpuesta de los conteos, pues las funciones dist() y PoissonDistance() calculan las distancias entre las filas. A continuación se muestran los heatmaps para las métricas Euclidiana, basada en la correlación de Pearson y la distancia de Poisson.
Heatmap con la métrica Euclidiana sobre las cuentas crudas.
Code
# Se encuentra la matriz de distancias
sample_dist_euc_raw <- dist(t(assay(dds)))
sampleDistMatrix_euc_raw <- as.matrix(sample_dist_euc_raw)
colors <- colorRampPalette( rev(brewer.pal(9, "Blues")) )(255)
pheatmap(sampleDistMatrix_euc_raw,
clustering_distance_rows = sample_dist_euc_raw,
clustering_distance_cols = sample_dist_euc_raw,
col = colors)
Para que se tenga una contribución approximadamente igual de todos los genes, se consideran los datos transformados por VST (almacenados en el objeto vsd) y se calcula la distancia Euclidiana.
Code
# Se encuentra la matriz de distancias
sample_dist_euc_vst <- dist(t(assay(vsd)))
sampleDistMatrix_euc_vst <- as.matrix(sample_dist_euc_vst)
colors <- colorRampPalette( rev(brewer.pal(9, "Blues")) )(255)
pheatmap(sampleDistMatrix_euc_vst,
clustering_distance_rows = sample_dist_euc_vst,
clustering_distance_cols = sample_dist_euc_vst,
col = colors)
Code
# Se encuentra la matriz de distancias
sample_dist_pear_vst <- get_dist(t(assay(vsd)), method = "pearson")
sampleDistMatrix_pear_vst <- as.matrix(sample_dist_pear_vst)
colors <- colorRampPalette( rev(brewer.pal(9, "Blues")) )(255)
pheatmap(sampleDistMatrix_pear_vst,
clustering_distance_rows = sample_dist_pear_vst,
clustering_distance_cols = sample_dist_pear_vst,
col = colors)
Otra opción para calcular distancias de muestra es utilizar la distancia de Poisson, implementada en el package PoiClaClu. Esta medida de disimilitud entre conteos también tiene en cuenta la estructura de varianza inherente de las cuentas al calcular las distancias entre muestras. La función PoissonDistance toma la matriz de conteos original (no normalizada) con las muestras como filas en lugar de columnas.
Code
# Se encuentra la matriz de distancias
sample_dist_pois <- PoissonDistance(t(counts(dds)))
sampleDistMatrix_pois <- as.matrix(sample_dist_pois$dd)
rownames(sampleDistMatrix_pois) <- dds$names
colnames(sampleDistMatrix_pois) <- dds$names
colors <- colorRampPalette( rev(brewer.pal(9, "Blues")) )(255)
pheatmap(sampleDistMatrix_pois,
clustering_distance_rows = sample_dist_pois$dd,
clustering_distance_cols = sample_dist_pois$dd,
col = colors)
En las gráficas anteriores se observa que cuando no se realiza la normalización y transformación de los datos los resultados del análisis de distancias pueden tener errores. Como es el caso del análisis con distancias Eucllidianas sin transformar en el que pareciera que las replicas de la línea celular MK no son nada parecidas. Mientras que al analizar las líneas celulares con la transformación VST aumenta la similitud entre las réplicas, aunque se observa que las réplicar de G1E son más parecidas entre sí que las de MK. Con la correlación de Pearson se obtienen los valores más altos mayores.
PCA
DESeq2 cuenta con la función plotPCA() la cual lleva a cabo un análisis de componentes principales considerando como variables los transcritos (toma por default los primeros ntop=500) y como observaciones las muestras. El resultado es la gráfica de los scores en el subespacio generado por las dos primeras componentes principales.
Code
plotPCA(vsd , intgroup="cell")
En esta gráfica se observa que las réplicas de G1E son muy parecidas entre sí, mientras que las de MK no.
O bien, podemos utilizar el script que desarrollamos previamente, nótese que es necesario aplicar la función sobre la matriz transpuesta de las cuentas (en este caso las correspondientes a VST)
En este caso, los dos primeros componetes explican alrededor del 90% de la variación. El análisis de PCA puede ayudar a identificar patrones de variación en la expresión génica entre las diferentes líneas celulares. Al proyectar los datos de transcritos en un espacio de menor dimensión se puede revelar la variación y agrupar las muestras (G1E y MK ambas con dos réplicas) en función de su similitud. Además, el PCA puede proporcionar información sobre los transcritos que contribuyen más a la variación, y de esta forma pueden ayudar a identificar genes entre las líneas estudiadas.
Análisis de expresión diferencial
El análisis de expresión diferencial se lleva a cabo sobre las cuentas originales por medio de la función DESeq:
dds <- DESeq(dds)using pre-existing size factorsestimating dispersionsgene-wise dispersion estimatesmean-dispersion relationshipfinal dispersion estimatesfitting model and testingddsclass: DESeqDataSet
dim: 359 4
metadata(1): version
assays(4): counts mu H cooks
rownames(359): NM_001024952 MSTRG.7.1 ... MSTRG.358.1 MSTRG.359.1
rowData names(22): baseMean baseVar ... deviance maxCooks
colnames(4): G1E_rep1 G1E_rep2 MK_rep1 MK_rep2
colData names(3): names cell sizeFactorEsta función muestra mensajes de los pasos realizados (ver ?DESeq). Los cuales son: estimar los factores de tamaño (controlando las diferencias en la profundidad de secuenciación de las muestras), la estimación de los valores de dispersión para cada gen y el ajuste de un modelo lineal generalizado.
El objeto generado es de la clase DESeqDataSet que contiene todos los parámetros ajustados y tablas de resultados.
Tabla de resultados
Al llamar los resultados sin ningún argumento muestra los log2 fold changes y p-values para la última variable en la fórmula del diseño experimental (en este caso sólo es una variable). Si existieran más de dos niveles en esta variable, los resultados mostrarían la tabla de comparación del último nivel respecto al primer nivel.
Code
res <- results(dds)
reslog2 fold change (MLE): cell G1E vs MK
Wald test p-value: cell G1E vs MK
DataFrame with 359 rows and 6 columns
baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj
<numeric> <numeric> <numeric> <numeric> <numeric> <numeric>
NM_001024952 4.58123 0.0488519 3.18513 0.0153375 0.987763 NA
MSTRG.7.1 6.55401 -0.6334148 2.46508 -0.2569551 0.797213 0.85974
MSTRG.8.1 7.43120 -1.7231046 2.35914 -0.7303961 0.465148 0.57815
MSTRG.1.1 2.54861 0.9148084 3.47067 0.2635829 0.792101 NA
MSTRG.9.1 2.86126 3.1664089 4.01910 0.7878394 0.430791 NA
... ... ... ... ... ... ...
MSTRG.357.1 1.83409 1.62935 3.93965 0.413577 0.6791837 NA
MSTRG.361.1 27.29284 -3.11403 1.34622 -2.313173 0.0207131 0.0515021
MSTRG.362.1 3.26117 -5.11248 4.00011 -1.278084 0.2012196 NA
MSTRG.358.1 4.55392 -6.95601 4.21178 -1.651563 0.0986236 NA
MSTRG.359.1 3.72594 -6.66930 4.53816 -1.469605 0.1416687 NALa tabla muestra los valores de expresión de G1E con respecto a MK. Los valores positivos indican que los transcritos de G1E tienen mayor expresión que en las líneas de MK. Por el contrario, los valores negativos indican una expresión menor en G1E.
Es posible extraer la tabla como una DataFrame, la cual contiene metadatos con información del significado de las columnas:
Code
res_df <- results(dds, contrast = c("cell", "G1E", "MK"))
# Se crea una versión tibble
res_tibble <- as_tibble(res_df)
#Se crea una data frame usual
res_data_frame <- as.data.frame(res_df)
mcols(res_df, use.names = TRUE)DataFrame with 6 rows and 2 columns
type description
<character> <character>
baseMean intermediate mean of normalized c..
log2FoldChange results log2 fold change (ML..
lfcSE results standard error: cell..
stat results Wald statistic: cell..
pvalue results Wald test p-value: c..
padj results BH adjusted p-valuesLa primera columna, baseMean, es el promedio de los valores de las cuentas normalizadas, divididos por los factores de tamaño, tomados de todas las muestras en el DESeqDataSet. Las cuatro columnas restantes se refieren a la comparación del nivel G1E sobre el nivel de referencia MK para la variable cell.
La columna log2FoldChange es la estimación del tamaño del efecto consecuencia de la condición experimental. Nos dice cuánto parece cambiar la expresión del gen entre las líneas celulares. Este valor se reporta en una escala logarítmica en base 2.
La incertidumbre asociada a esta estimación está disponible en la columna lfcSE, que es el error estándar del valor estimado del log2FoldChange.
El propósito de un análisis de expresión diferencial es comprobar si los datos proporcionan evidencia suficiente para concluir que el log2FoldChange es significativamente diferente de cero. DESeq2 realiza para cada transcrito una prueba de hipótesis para ver si la evidencia es suficiente para rechazar la hipótesis nula (que la diferencia de expresión es cero y que la diferencia observada entre líneas celulares es causada simplemente por la variabilidad experimental). Como es habitual en estadística, el resultado de esta prueba se reporta por medio de un p-value. DESeq2 utiliza la corrección de Benjamini-Hochberg (BH) que controla la False Discovery Rate (FDR) : la proporción esperada de falsos positvios entre todas las hipótesis rechazadas, es decir, la FDR mide cuántos de los casos considerados significativos (rechazo de la hipótesis nula) son probablemente falsos. En DESeq se calcula para cada gen un p-value ajustado dado en la columna padj y por default considera un treshold de 0.1 para evaluar la hipótesis.
Podemos resumir los resultados con la siguiente línea de código, que proporciona información adicional.
Code
summary(res)
out of 359 with nonzero total read count
adjusted p-value < 0.1
LFC > 0 (up) : 55, 15%
LFC < 0 (down) : 48, 13%
outliers [1] : 0, 0%
low counts [2] : 139, 39%
(mean count < 6)
[1] see 'cooksCutoff' argument of ?results
[2] see 'independentFiltering' argument of ?resultsGráficas de resultados
MA plot
El MA plot representa la distribución de los coeficientes estimados en el modelo, es decir, la distribución de los genes o transcritos en las comparaciones de interés. En el eje y, la M corresponde a “minus”, es la diferencia del logaritmo de los valores que es equivalente al logaritmo del cociente. Y en el eje de de las x, A corresponde a average, que es el promedio de las cuentas normalizadas para cada gen en todas las muestras.
Este gráfico se puede generar con la función plotMA() :
Code
plotMA(res)
El log fold change se utiliza para medir la magnitud del cambio en la expresión génica entre MK y G1E. Este se calcula con el logaritmo base 2 de la proporción entre las expresiones génicas en las dos líneas celulares. En la gráfica, un log fold chance negativo indica que la expresión génica es menor en G1E y mayor MK. Mientras que los valores cercanos a 0 indican que no hay cambio en la expresión entre G1E y MK.
O bien, podemos utilizar ggplot2 para generarla y poder modificar los atributos (se muestra una versión básica):
Code
res_tibble <- mutate(res_tibble, isDE=if_else(padj<0.1, "DE", "nDE", missing="nDE"))
res_tibble$isDE <- factor(res_tibble$isDE)
ggplot(res_tibble)+
geom_point(aes(baseMean, log2FoldChange, color=isDE), size=2, show.legend = TRUE)+
scale_x_log10()+
theme_bw()
También es posible generar un MA plot interactivo y gráficas de expresión para genes específicos con el package Glimma, para ello es necesario crear una variable group que corresponda a los niveles asociados al diseño experimental.
group <- colData(dds)$cell
dds$group <- group
glimmaMA(dds)139 of 359 genes were filtered out in DESeq2 testsVolcano plot
De manera análoga al MA plot, en el volcano plot se distinguen los genes o transcritos que muestran expresión diferencial entre líneas celulares. En las ordenadas se grafica \(-log_{10}(padj)\) y en las abscisas el log2FoldChange. Este gráfico se puede realizar por medio de la función EnhancedVolcano , a continuación se muestra el volcano plot básico.
Code
EnhancedVolcano(res,
lab= rownames(res),
x='log2FoldChange',
y= 'pvalue')
También es posible utilizar el package Glimma para una versión interactiva del gráfico.
Code
glimmaVolcano(dds)A partir de los datos podemos generar el plot con ggplot2.
Code
res_tibble <- mutate(res_tibble, neglog10padj=if_else(is.na(padj), 0, -log10(padj)))
ggplot(res_tibble)+
geom_point(aes(log2FoldChange, neglog10padj, color=isDE), size=2, show.legend = TRUE)+
theme_bw()
Heatmap
Por medio de un heatmap con agrupamiento podemos visualizar la expresión de los genes diferencialmente expresados en términos de las cuentas normalizadas estandarizadas.
Code
# Se filtran los transcritos con expresión diferencial
significant <- res_data_frame |> filter(log2FoldChange > 0 & padj < 0.1 |
log2FoldChange < 0 & padj < 0.1)
##Se extrae la matriz de cuentas normalizadas
norm_counts <- counts(dds, normalized = T)
##Se filtran las filas que corresponden a los transcritos significativos
norm_counts <- norm_counts[rownames(significant), ]
##Generar una tabla de anotaciones que incluye el tipo de células
annotation_col <- coldata[, c("names","cell")]
##Generar el heatmap empleando clustering jerarquico
pheatmap(norm_counts,
border_color = NA,
scale = "row",
clustering_distance_rows = "euclidean",
clustering_distance_cols = "euclidean",
clustering_method = "average",
show_colnames = T,
show_rownames = F,
annotation_col = annotation_col)
Esta gráfica nos permite ver la expresión diferencial con los datos normalizados. Se observa que los genes de G1E tienen mayor expresión que los de MK. Por el contrario, MK presenta más genes con subexpresión.
La expresión diferencial tiene gran importancia ya que permite comprender cómo se regulan los genes en distintos tipos celulares. Esta comparación también permite identificar qué genes están activos o silenciados. Además, puede brindar información sobre los procesos biológicos que ocurren en cada línea celular y de esta forma identificar patrones de expresión asociados a enfermedades.
Bibliografía
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