scRNA_lianxi
shengwei lin
2023-09-13
scRNA分析流程（10X平台）
稀疏矩阵的读取
1.10X平台的单细胞数据一般有三个文件组成，barcodes.tsv存的是细胞信息，genes.tsv存的是基因信息，matrix.mtx里面存的是表达信息（以稀疏矩阵的格式储存）
2.稀疏矩阵优点 数据量大：单细胞RNA测序数据的基因表达矩阵非常庞大。而在稀疏矩阵中，只有非零元素才会占用内存。 零值丰富：在单细胞数据中，大多数基因在大多数细胞中的表达是低的或者不存在的，因此基因表达矩阵中有大量的零值。 计算效率：使用稀疏矩阵可以减少计算操作中的零值元素，从而提高计算效率。 内存优化：使用稀疏矩阵可以减少内存占用，使得可以处理更大规模的数据集。 如果数据集比较大，可以直接使用Seurat包中的Read10X()函数进行读取，但是需要这三个文件名一致。
#稀疏矩阵的读取
library(tidyverse)
library(Seurat)#Seurat包读取10X数据
# 加载pbmc文件
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "E:/GoodStudy/research/技能库/Data Science/单细胞/pbmc3k")
# 使用原始（非标准化数据）初始化Seurat对象
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)Read10X()读取数据，然后使用CreateSeuratObject()将数据转换成Seurat格式。并且通过min.cells和min.features两个参数直接对数据进行过滤。
min.cells: 指一个细胞至少有多少个基因表达才能被保留。如果一个细胞的基因表达数量太低，它可能是一个质量较差的细胞。
min.features: 指一个基因至少在多少个细胞中表达才被保留。如果一个基因的表达数量太低，它可能是一个低表达基因，过滤掉这些基因可以减少噪音和计算负担。
pbmc.data[c("CD3D", "TCL1A", "MS4A1"), 1:30]## 3 x 30 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
##
## CD3D 4 . 10 . . 1 2 3 1 . . 2 7 1 . . 1 3 . 2 3 . . . . . 3 4 1 5
## TCL1A . . . . . . . . 1 . . . . . . . . . . . . 1 . . . . . . . .
## MS4A1 . 6 . . . . . . 1 1 1 . . . . . . . . . 36 1 2 . . 2 . . . .矩阵中的值代表0（未检测到的基因值）。由于scRNA-seq矩阵中的大多数值都是0，因此Seurat尽可能都使用稀疏矩阵表示。这会显著节省数据的内存和速度
Seurat 数据格式的设计旨在方便处理、分析和可视化单细胞RNA测序数据。它是一个包含原始数据矩阵、元数据、分析结果和其他信息的复杂数据结构。后续分析的数据结果都可以储存在Seurat格式数据里面。包含一下几个部分：
- 原始数据矩阵：原始数据矩阵包含了单细胞RNA测序实验中每个细胞中每个基因的表达值。原始数据矩阵存储在Seurat对象的raw.data属性中。
- 细胞和基因元数据：细胞和基因的元数据包含了关于细胞和基因的附加信息，如细胞类型、样本来源、基因注释等。细胞和基因的元数据通常存储在Seurat对象的meta.data和features属性中。
- 聚类结果和降维结果：Seurat支持细胞聚类和降维分析，其结果可以存储在Seurat对象的seurat_clusters和dr属性中，分别代表细胞聚类和降维分析结果。
- 差异表达分析结果：如果进行了差异表达分析，Seurat可以存储不同细胞簇之间的差异表达基因，并将结果存储在Seurat对象的de属性中。
- 可视化信息：Seurat对象中还可以包含各种可视化信息，如降维图、聚类图等，以便更好地理解和呈现数据。
数据预处理
Seurat中scRNA-seq 数据的标准预处理流程。包括数据的质控(QC)、标准化、特征基因选择以及均一化。
数据质控
常用的质控标准： * 在每个细胞中检测到的基因的数量。例如：低质量的细胞或空滴通常只有很少的基因，而细胞双联体或多联体可能检测到异常高的基因。 * 在细胞内检测到的基因总数。 * 线粒体基因的含量。低质量/垂死细胞通常表现出的线粒体污染（线粒体基因占比高） 第一种方法：线粒体基因是以MT-开头的，可以使用PercentageFeatureSet()函数计算线粒体基因的占比。
# 通过PercentageFeatureSet()函数计算线粒体基因占比并储存在pbmc[["percent.mt"]]中
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")
head(pbmc[["percent.mt"]])## percent.mt
## AAACATACAACCAC-1 3.0177759
## AAACATTGAGCTAC-1 3.7935958
## AAACATTGATCAGC-1 0.8897363
## AAACCGTGCTTCCG-1 1.7430845
## AAACCGTGTATGCG-1 1.2244898
## AAACGCACTGGTAC-1 1.6643551第二种方法：在创建CreateSeuratObject()时，会自动计算count值，基因数量以及线粒体基因占比，并储存在meta data中。
head(pbmc@meta.data)#直接提取## orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt
## AAACATACAACCAC-1 pbmc3k 2419 779 3.0177759
## AAACATTGAGCTAC-1 pbmc3k 4903 1352 3.7935958
## AAACATTGATCAGC-1 pbmc3k 3147 1129 0.8897363
## AAACCGTGCTTCCG-1 pbmc3k 2639 960 1.7430845
## AAACCGTGTATGCG-1 pbmc3k 980 521 1.2244898
## AAACGCACTGGTAC-1 pbmc3k 2163 781 1.6643551- orig.ident：表示原始数据的标识符或名称。有多个数据集时，可以用来区分不同数据集。
- nCount_RNA：这个值表示每个细胞在RNA测序中的总counts计数。
- nFeature_RNA：这个值表示在每个细胞中检测到的不同基因的数量。
- percent.mt：线粒体基因的占比，较高的值可能表示细胞的线粒体损伤或其他异常。
#使用VlnPlot()函数进行这三个值的可视化
VlnPlot(pbmc, features = c("nCount_RNA", "nFeature_RNA","percent.mt"), ncol = 3)
可以看到线粒体基因都在5%以下，nFeature基本在200-2000之间，可以根据图示结果筛选去除线粒体基因和选择保留基因数量的区间。
#可以使用FeatureScatter()可视化这三个特征之间的关系
plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2
可以看到nCount_RNA和线粒体基因间无相关，表明测序得到的Count基本都是细胞的功能基因，nCount_RNA和nFeature_RNA间强相关，符合逻辑。
根据上面的信息，我们选择过滤基因超过2500或少于200，且线粒体基因 >5% 的细胞，并生成新的Seurat数据
# 数据过滤
pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)数据标准化
单细胞RNA测序数据在进行分析之前通常需要进行标准化和归一化，通常使用LogNormalize标准化方法。标准化的是为了处理数据中的技术偏差、增强信号和降低噪音，从而使得数据更适合于后续的分析。
pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)scale.factor值(值默认为10000)的调整主要考虑数据的总体表达水平和表达值分布。如果数据的总RNA计数较高或基因的表达值集中在较低区域，可以选择较小的 scale.factor。反之选择较高的值，也可以根据下游分析结果进行调整。标准化的结果存储在pbmc[[“RNA”]]@data中
head(pbmc[["RNA"]]@data)## 6 x 2638 sparse Matrix of class "dgCMatrix"
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . 1.646272 . . . . . . . . 1.398186 . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . 1.89939 . . . . . . . 1.36907 1.721224 . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . 1.568489 1.678814 . 1.253835 . . 3.791113 . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . 1.608798 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . 1.616515 . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . 0.965166 . . . . . . . . 1.433623 . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . 1.893136 . . . . . . . . 1.378545 . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.499505 . 2.062221 . . . . . . . . . . . . . . 2.076734 . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.648982 2.417208 . . . . . . 1.389076 . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . 1.227629 . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 1.647626 . . 2.447522 . . . . . . 1.895535 . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . 1.540524 . . . 1.763975 . . . . . . 1.733011 1.772846 . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . 1.818935 . . . . . . . . 1.545731 . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . 2.070654 . 1.831155 . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.787191 . . . . . . 1.325268 . . . 1.568489 . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . 2.330691 1.731479 . . . . . . . . . . . . . . . 1.867247
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . 1.04354 1.568189 . . . . . 1.717839 1.706673 . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . 1.618783 . . 1.34403 . . . . . 1.401638 . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . 1.743441 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.837343 . . .
## NOC2L 1.460976 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.803522 . . . . . . . . . . . . . . . . 1.862177 . . . .
##
## AL627309.1 1.538223 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . 1.525431 . . . . . . . . .
## NOC2L . 2.265849 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . 1.940615 1.432166 . . . . . 1.896016 . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . 1.746561 . . 1.281714 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.349292 . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.3384 . . . . . . . 1.906185 . 2.010668 . . 1.07251 . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.140864 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.9608 . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . 0.9241624 . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . 1.550395 . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . 2.261602 . . 1.723868 . . . 1.719718 . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . 1.425649 . 1.741498 . . . . . . 1.8917 .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . 1.195661 . . . . . . . . 1.841349 1.492249 1.37104 . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . 1.073017 . . . . . . . . 2.052104 . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . 2.050332 . 1.82633 . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.384369 . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . 1.836899 . . . . . . . 1.661311 . . . . . . . . 1.629908
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . 1.581552 . . . . . 1.696776 . . . 1.803099 . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . 1.654092 . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.844481 . 1.457174 . 1.535644 . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.896497 . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . 1.684511 . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.562799 . . 2.497187 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . 2.068235 . . . . . . . . . . . 1.80905
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.99734 . . . . . . . . . . . . . . . 0.8101671 2.020252 . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . 1.054872 . . . 1.450889 . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.062495 . 2.097141 . . . . . . . . . 2.666317 . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.509859 . . . . . 1.656833 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 1.363197 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . 1.878902 . . . . . . . . . . . . . . 1.36298 . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . 1.079773 . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . 1.394525 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 1.788849 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . 1.283598 . . . . . . . . 1.730332 . . . . 1.500587 . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . 1.787191 . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . 1.860801 . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.482703 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.255463 . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . 1.155412 . . . . 1.592691
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . 1.288525 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 2.349771 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.618459 .
## NOC2L . . . . . . . . . . . 1.502213 . . . 1.40604 . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.238658 1.646948 . . . 1.52995
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . 1.307094 . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.034336 . . 0.9948981 1.728424 . . . 2.24975 . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . 1.35141 . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . 1.122644 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . 2.2437 . . . . . . . 1.791343 . . . . . . 1.921955
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . 1.504116 . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . 1.468392 . . 1.245137 . . . . . 1.661311 .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . 1.684869 . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . 1.684869 . . . . . . .
## NOC2L . 1.653408 . . . . . . . . . . 1.242501 . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . 1.806068 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . 1.322233 . . . . . . . .
## NOC2L 1.611682 . . . . . . . . . . 1.05695 . . . . . . 0.962958
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . 1.776507 . . . . . . . 1.132528 . . . . . . 1.790511 . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . 1.684511 . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 1.684511 1.414703 . . . . . . . . 1.40511 . . . . . . 2.149609
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . 1.073523 . . . . . . . . 1.346971 . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.603068 . . . . . . . . . . . . . 1.617486 . . . . . . 2.446558
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.796777 . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.662349 . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.497077 . . . . . . . . . . . . . 1.222365 . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . 1.872585 . 1.691699 . . . 1.963954 1.408836 . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 1.71634 . . . 2.021671 . 1.402793 . . . 2.113604 1.320822 . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . 2.011229 1.32385 . 2.226555 . . . . . . 1.677397 .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.585861 . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . 1.730332 . . . . . . . . . . . 2.366671 . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.674925
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.568489 . . . . . . . . . . . . . . . . 2.029957 . . 1.674925
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . 1.882199 . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.78595 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.360174 . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 2.105963 . . . 1.965008 . . . . . . . . . . . 1.177013 1.489317
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.840903 . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . 1.596132 . . . . 1.589888 . . . 1.876556 . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . 1.631229 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . 0.7831497 . . 1.629908 . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . 1.238484 1.696412 . . 1.721601 . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . 1.680234 . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 1.624977 . . . . . . . . . . . . 1.964481 . . 1.635541 . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.323445 . . . . . 1.521502
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.52995 . . . 1.179036 . . . . 1.293878 . . . 1.102494 . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . 1.690256 . . . 1.622362 1.179972 . . . . . . . . 2.133695 .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.68059 . 1.07403 . 1.10236 .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . 1.220678 1.216316 . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 1.217990 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.751071 . . . . . . . 1.550687 . . . . . . . . . . . 2.00453 . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.602118 . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.818935 . . . . . . . 2.662588 . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.074284 . . . 1.710375 . . . . . . . . . . 2.28109 . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . 1.441949 1.641556 . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . 2.414422 . . . . . . . . . . . . . 2.049742 .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . 1.386369 . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.971897 . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.699328 . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 2.086871 . . . . . . . . 1.610719 . 1.567287 . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.64661 . . . . 1.560418 . . . . . 1.715218 . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 1.752056 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.865861 . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.823711 . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.078363 .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 2.07126 2.042117 . . . . 1.229167 . . . . 1.224227 . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . 1.901810 . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . 1.450889 . . . 2.517375 . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.828519 . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 0.9490601 . . 1.44343 . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.037737 . . . . . . 1.828958 . . . . . 1.821102 . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . 1.441456 . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . 1.441949 . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L 1.212818 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . . . . . 1.632553 . . . . . . . . . . 1.690616 .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . 1.541966 . . .
## NOC2L 1.070365 . . . . . . 1.460213 . . . . . 1.956093 1.861718
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . 2.651496 . 2.007872 . . . 2.113924 . . . . . . . . . . . . . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 1.610399 . . . . . . . . . . . . . 1.406737
## NOC2L . . . . . . . 1.786363 . . 1.477983 . 1.787191 . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . 1.586479 . . 1.370602 . . . . 1.401869 . . . . . 1.60402 . .
##
## AL627309.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## AP006222.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.2 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## RP11-206L10.9 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
## LINC00115 . . . . . 1.313221 . . . . . . . . . . . .
## NOC2L . . . . . 1.313221 . . . . . . . . . . . .特征基因选择
特征基因指的时在某些细胞中表达，而在其他细胞中低表达。特征基因在后面用来降维(PCA、t-SNE、UMAP等)以及给细胞分群使用。FindVariableFeatures()函数可以实现特征基因的选择。默认情况下选择2000个特征基因。
## 特征基因的选择
pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
## 查看差异最大的10个基因
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)
top10## [1] "PPBP" "LYZ" "S100A9" "IGLL5" "GNLY" "FTL" "PF4" "FTH1"
## [9] "GNG11" "S100A8"# 可视化特征基因
plot3 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot3
plot4 <- LabelPoints(plot = plot3, points = top10, repel = TRUE)#并标出前10个差异最大的基因
plot4
数据均一化
使用ScaleData()函数(也就是Z-score)进行数据均一化，一般消除线粒体基因含量的影响，可以减少细胞周期、批次效应等影响。均一化后的数据储存在pbmc[[“RNA”]]@scale.data中。
tips:如果要对所有基因进行均一化，就先均一化再进行特征选择！
### 均一化
all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)
#head(pbmc[["RNA"]]@scale.data,1)太多不查看了数据降维
不管用tSNE或者Umap聚类降维，都存在数据维度过大的问题，因此需要先做PCA进行线性降维，把维度降低到一定范围内，再执行后续操作。
PCA降维
默认情况下，使用之前确定的特征基因作为降维的输入，如果希望选择不同的子集，则可以使用features参数进行定义。
# PCA
pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc)) #运行PCA
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5) #看一下看五个成分## PC_ 1
## Positive: CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL
## Negative: MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2
## PC_ 2
## Positive: CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1
## Negative: NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA
## PC_ 3
## Positive: HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1
## Negative: PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11
## PC_ 4
## Positive: HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1
## Negative: VIM, IL7R, S100A6, IL32, S100A8
## PC_ 5
## Positive: GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY
## Negative: LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7PCA结果可视化
Seurat提供了几种方法来可视化PCA结果，包括VizDimLoadings()、DimPlot()和DimHeatmap()。
VizDimLoadings()用来查看主成分分析（PCA）降维后的每个基因在不同主成分上的贡献程度，可以确定贡献比较大的基因。
VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")
#前两个成分，各个基因贡献度- DimPlot()用来绘制降维后的数据在指定的维度上的散点图。可以直观地观察细胞在降维空间中的分布模式，是否存在明显的细胞群集或聚类。
DimPlot(pbmc, reduction = "pca")
*
DimHeatmap()用来在指定的降维维度上创建一个热图，显示一部分细胞的基因表达模式。可以帮助观察在降维后的空间中，某些基因在细胞之间的表达差异情况。
DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE) 
可以同时绘制多个
DimHeatmap(pbmc, dims = 1:3, cells = 500, balanced = TRUE) 
### 确定数据集的“维度”
确定数据维度在单细胞RNA测序数据分析中非常重要，合适的数据维度有助于在可视化和分析中更好地捕捉细胞间的差异和结构。
- JackStrawPlot()用来确定数据维度，根据其的结果，通常选择在p值显著下降的主成分之前的维度作为数据的维度。不过这个函数运行速度较慢，可以使用ElbowPlot()函数。
pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)
JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)
- ElbowPlot()通过绘制PCA的方差解释比例曲线（Scree Plot）来帮助识别主成分数量的“肘部”位置，从而确定降维后的维度数量。
#ElbowPlot()聚类分析——非线性降维要求
聚类是将相似的细胞分组在一起的过程，因此在进行聚类之前，需要明确细胞之间的相似性关系，FindNeighbors()函数可以构建细胞之间的近邻图，从而捕捉细胞的相似性和关联性。
pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
##
## Number of nodes: 2638
## Number of edges: 95927
##
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8728
## Number of communities: 9
## Elapsed time: 0 seconds非线性降维（UMAP/tSNE）
Seurat提供了几种非线性降维技术，例如tSNE和UMAP，用来可视化和探索这些数据集。这些算法的目标是学习数据的底层Manifold。 * MAP降维
pbmc <- RunUMAP(pbmc, dims = 1:10) #运行UMAP降维
DimPlot(pbmc, reduction = "umap") #可视化
saveRDS(pbmc, file = "E:/GoodStudy/research/技能库/Data Science/单细胞/pbmc_tutorial.rds") #将数据保存- tSNE降维
pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10)
DimPlot(pbmc, reduction = "tsne") 
## 细胞注释
差异表达基因
FindAllMarkers()是用于寻找差异表达基因的函数，识别在不同细胞簇(cluster)中特异性表达的基因，从而揭示细胞簇之间的生物学差异。
识别cluster2的差异基因
cluster2.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 2, min.pct = 0.25)
head(cluster2.markers, n = 5)## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj
## IL32 2.892340e-90 1.2013522 0.947 0.465 3.966555e-86
## LTB 1.060121e-86 1.2695776 0.981 0.643 1.453850e-82
## CD3D 8.794641e-71 0.9389621 0.922 0.432 1.206097e-66
## IL7R 3.516098e-68 1.1873213 0.750 0.326 4.821977e-64
## LDHB 1.642480e-67 0.8969774 0.954 0.614 2.252497e-63- 参数ident.1是一个整数，指定了要比较的簇的标识号。
- 参数min.pct表示在至少在百分之多少的细胞中表达某个基因，才被考虑为差异表达基因
cluster之间对比——识别cluster5的差异基因
cluster5.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 5, ident.2 = c(0, 3), min.pct = 0.25)
head(cluster5.markers, n = 5)## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj
## FCGR3A 8.246578e-205 4.261495 0.975 0.040 1.130936e-200
## IFITM3 1.677613e-195 3.879339 0.975 0.049 2.300678e-191
## CFD 2.401156e-193 3.405492 0.938 0.038 3.292945e-189
## CD68 2.900384e-191 3.020484 0.926 0.035 3.977587e-187
## RP11-290F20.3 2.513244e-186 2.720057 0.840 0.017 3.446663e-182表示将cluster0和cluster3的细胞簇与cluster5的细胞簇进行比较，并识别出差异基因。
所有cluster的差异基因
pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% slice_max(n = 2, order_by = avg_log2FC)## # A tibble: 18 × 7
## # Groups: cluster [9]
## p_val avg_log2FC pct.1 pct.2 p_val_adj cluster gene
## <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <dbl> <fct> <chr>
## 1 9.57e- 88 1.36 0.447 0.108 1.31e- 83 0 CCR7
## 2 3.75e-112 1.09 0.912 0.592 5.14e-108 0 LDHB
## 3 0 5.57 0.996 0.215 0 1 S100A9
## 4 0 5.48 0.975 0.121 0 1 S100A8
## 5 1.06e- 86 1.27 0.981 0.643 1.45e- 82 2 LTB
## 6 2.97e- 58 1.23 0.42 0.111 4.07e- 54 2 AQP3
## 7 0 4.31 0.936 0.041 0 3 CD79A
## 8 9.48e-271 3.59 0.622 0.022 1.30e-266 3 TCL1A
## 9 5.61e-202 3.10 0.983 0.234 7.70e-198 4 CCL5
## 10 7.25e-165 3.00 0.577 0.055 9.95e-161 4 GZMK
## 11 3.51e-184 3.31 0.975 0.134 4.82e-180 5 FCGR3A
## 12 2.03e-125 3.09 1 0.315 2.78e-121 5 LST1
## 13 3.13e-191 5.32 0.961 0.131 4.30e-187 6 GNLY
## 14 7.95e-269 4.83 0.961 0.068 1.09e-264 6 GZMB
## 15 1.48e-220 3.87 0.812 0.011 2.03e-216 7 FCER1A
## 16 1.67e- 21 2.87 1 0.513 2.28e- 17 7 HLA-DPB1
## 17 1.92e-102 8.59 1 0.024 2.63e- 98 8 PPBP
## 18 9.25e-186 7.29 1 0.011 1.27e-181 8 PF4- 参数only.pos为TRUE时，表示仅考虑在至少一个细胞群中呈现正向差异表达的基因。
- 参数logfc.threshold是一个阈值，表示logFC的最小值，用于筛选显著的差异表达基因。
差异基因可视化
VlnPlot()用于绘制小提琴图（Violin Plot）
适用于展示单细胞RNA测序数据中基因的表达分布情况。
VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))
VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)
* slot: 是一个选择要使用数据的参数。这里选择的是”counts” 数据。 * log:
是一个逻辑值，用于指示是否在绘图时对表达数据进行对数转换。
FeaturePlot()用于绘制特征图
可以观察基因在不同细胞上的表达水平，从而更好地理解细胞类型和状态的差异。
FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", "CD8A"))
#### DoHeatmap()用于绘制基因表达热图
可视化基因在不同样本、细胞类型或条件下的表达模式。选择每个cluster中logFC变化最大的前10个差异表达基因，绘制热图
top10 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_log2FC)
DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()
细胞类型注释
在这个数据集里，使用上面的差异基因和已知细胞类型的marker基因进行匹配（marker基因可以由其他数据库获得，或自己定义）
将细胞类型匹配到UMAP图中 
new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "CD14+ Mono", "Memory CD4 T", "B", "CD8 T", "FCGR3A+ Mono","NK", "DC", "Platelet")
names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
pbmc <- RenameIdents(pbmc, new.cluster.ids)
DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()
saveRDS(pbmc, file = "E:/GoodStudy/research/技能库/Data Science/单细胞/pbmc3k_final.rds") #保存结果