1 Цель

Показать возможность раздельного определения тотального, мономерного и олигомерных форм уромодулина методом иммуноферментного анализа в моче.

2 Задачи

  1. Доступными методами охарактеризовать биохимические и биофизические свойства мочи здоровых добровольцев;
  2. Оценить уровень уромодулина и его олигомеров в образцах мочи и сыворотке крови;
  3. На основании полученных данных сделать вывод относительно возможности оценки уровня тотального уромодулина, его мономеров и олигомерных форм.

3 Методы

3.1 ELISA KIT

Для определения концентрации уромодулина (UMOD) в сыворотке крови и в моче используем ELISA kit Пробоподготовка КРОВЬ

Пробоподготовка МОЧА 1

Пробоподготовка МОЧА 2

3.2 Анализ треков наночастиц (NTA)

Измерение фракционного состава коллоида мочи проводят на анализаторе треков наночастиц NanoSight LM10 (Malvern). Образцы мочи разводят в 40 раз в дистиллированной воде, измерения проводят с использованием кюветы 488 нм. Серия из 3х последовательных измерений длительностью по 60 секунд.

3.3 Общеклинический анализ (ОКА)

Общеклинический анализ мочи проводился с использованием тест полосок Labstrip U11 Plus GL на анализаторе мочи DocUReader 2 Pro (77 Elektronika Kft, Венгрия). Определяем следующие параметры: билирубин, уробилиноген, кетоны (ацетоуксусная кислота), аскорбиновая кислота, глюкоза, протеин (альбумин), эритроциты (гемоглобин), уровень рН, нитриты, лейкоциты, удельный вес мочи.

3.4 Биохимический анализ мочи

Биохимический анализ сыворотки мочи проводили на автоматическом биохимическом анализаторе А-15 (BioSystems, Испания). В образцах мочи определяли концентрацию креатинина (Креатинин-Ново-А, Вектор-Бест, Россия), общий белок (Белок общий, Вектор-Бест, Россия), альбумин (Альбумин, Вектор-Бест, Россия).

3.5 Капиллярный электрофорез

Определение массовой концентрации катионов и анионов в моче и сыворотке крови проводили методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза КАПЕЛЬ-105M (Люмэкс, Россия). Свежесобранные образцы мочи для анализа центрифугировали 1800 x g 5 минут, отбирали супернатант, для анализа разбавляли его в 250 раз. В образцах сыворотки мочи проводили измерение массовой концентрации катионов аммония, калия, натрия, лития, магния, стронция, бария и кальция, а также измерение массовой концентрации анионов хлорид-, нитрит-, сульфат-, нитрат-, фторид- и фосфат-ионов.

3.6 Электрофорез

4 Результаты

В результате исследования полученны данные о биофизических и биохимических свойствах мочи (см. Таблица ?? )

ID Spices Sample Name Date Native Frozen Super Manipulation Bilirubin Urobilinogen Ketones Asc. acid Glucose Protein Blood Nitrite Density pH Conductivity Ions_NH4 Ions_K Ions_Na Ions_Ca Ions_file NTA_conc NTA_conc_sd NTA_mode NTA_mode_sd NTA_mean NTA_mean_sd NTA_D10 NTA_D10_sd NTA_D50 NTA_D50_sd NTA_D90 NTA_D90_sd NTA_file ELISA_UMOD_MEAN ELISA_UMOD_HDB_MEAN BioChem_TotalProt BioChem_Alb BioChem_Creat …44 Protein_ProteOrange Protein_Bradford
s307081x1 Human Urine VerlovNA 2023-08-08 TRUE FALSE FALSE none - - - - - 30 (0.3) - - 1.025 5.5 9.65 0.49 1.81 2.83 0.05 NA 6.97 0.16 131 10.2 198 4.6 97 2.6 158 3.1 346 11.5 NA 5836 10954 34.6 NA NA NA 35.1 34.5
s307082x1 Human Urine BurdakovVS 2023-08-08 TRUE FALSE FALSE none - - - 20.0 - 30 (0.3) - - 1.015 6.5 9.44 0.34 1.78 2.23 0.11 NA 6.60 0.48 141 12.5 228 6.3 111 2.2 184 8.9 388 13.6 NA 7335 14440 28.6 NA NA NA 26.3 23.5
s307083x1 Human Urine KulakovIA 2023-08-08 TRUE FALSE FALSE none - - - 40.0 - 30 (0.3) - - 1.025 5.0 10.84 1.28 3.13 2.61 0.08 NA 12.30 0.12 136 5.3 240 9.5 107 1.5 185 3.3 465 29.8 NA 10782 23036 75.1 NA NA NA 77.8 78.2
s307081x2 Human Urine VerlovNA 2023-08-08 FALSE FALSE FALSE filter300KDa - - - - - - - - 1.015 5.5 10.90 0.42 1.58 2.46 0.04 NA 0.92 0.02 145 11.9 238 33.3 113 6.4 218 47.7 373 57.3 NA 626 633 22.9 NA NA NA 24.0 23.7
s307082x2 Human Urine BurdakovVS 2023-08-08 FALSE FALSE FALSE filter300KDa - - - - - - - - 1.010 6.5 9.17 0.35 1.82 2.19 0.11 NA 0.54 0.10 133 17.9 187 39.6 100 16.6 164 32.2 290 70.4 NA 640 653 16.1 NA NA NA 15.0 12.1

4.1 ОКА мочи

Данные плотность (ОКА) образцов мочи представлены в Таблице 4.1.

Table 4.1: Плотность мочи, \(гр./см^3\)
Manipulation Среднее СКО Мин. Q1 Медиана Q3 Макс.
filter300KDa 1.016 0.006 1.01 1.011 1.015 1.019 1.025
none 1.018 0.006 1.01 1.015 1.018 1.024 1.025
Плотность, различия между образцами нативной мочи и фильтрованного образца

Figure 4.1: Плотность, различия между образцами нативной мочи и фильтрованного образца

Данные pH (ОКА) образцов мочи представлены в Таблице 4.2.

Table 4.2: pH
Manipulation Среднее СКО Мин. Q1 Медиана Q3 Макс.
filter300KDa 1.016 0.006 1.01 1.011 1.015 1.019 1.025
none 1.018 0.006 1.01 1.015 1.018 1.024 1.025
pH, различия между образцами нативной мочи и фильтрованного образца

Figure 4.2: pH, различия между образцами нативной мочи и фильтрованного образца

4.2 Анализ ионного состава мочи

Данные проводимости и концентрации катионов в образцах мочи представлены в Таблице ??.

Manipulation N Mean SD Min Q1 Median Q3 Max p.value
1 Conductivity filter300KDa 6 9.41 1.83 6.52 8.07 9.95 10.90 11.05 0.863
1.1 none 6 9.23 1.66 6.52 8.13 9.54 10.78 10.84
2 Ions_Na filter300KDa 6 2.40 0.53 1.70 2.15 2.33 2.69 3.24 0.717
2.1 none 6 2.53 0.60 1.50 2.23 2.68 2.83 3.23
3 Ions_K filter300KDa 6 1.57 0.69 0.55 1.13 1.66 1.82 2.59 0.819
3.1 none 6 1.68 0.87 0.58 0.99 1.77 1.81 3.13
4 Ions_Ca filter300KDa 6 0.13 0.08 0.04 0.06 0.11 0.20 0.23 0.970
4.1 none 6 0.13 0.07 0.05 0.08 0.10 0.21 0.23
5 Ions_NH4 filter300KDa 6 0.60 0.25 0.35 0.42 0.57 0.65 1.06 0.807
5.1 none 6 0.65 0.34 0.34 0.43 0.58 0.68 1.28

Графики проводимости и концентрации ионов в нативном образце мочи и после фильртации приведены на Рисунке (fig:FigUmod1IonsPval).

Сравнение проводимости (мкСм/см) и концентрации катионов (мг/мл) в образцах мочи до и после фильтрации

Figure 4.3: Сравнение проводимости (мкСм/см) и концентрации катионов (мг/мл) в образцах мочи до и после фильтрации

4.3 Определение концентрации белка

Измерение концентрации совокупного белка в моче проводили с использованием биохимического анализатора, методом Бредфорда и флуоресцентным методом с использованием ProteOrange. Данные о концентрации белка в обращцах мочи полученные вышеперечисленными мметодами приведены в таблице ??.

Manipulation N Mean SD Min Q1 Median Q3 Max p.value
1 BioChem_TotalProt filter300KDa 6 24.32 14.33 9.60 16.1 20.20 29.70 50.1 0.193
1.1 none 6 38.00 19.10 20.40 28.6 33.25 37.40 75.1
2 Protein_ProteOrange filter300KDa 6 25.36 14.86 10.16 15.0 22.95 28.48 52.6 0.272
2.1 none 6 37.60 20.91 17.43 26.3 33.67 36.70 77.8
3 Protein_Bradford filter300KDa 6 24.77 15.16 9.60 12.1 23.30 28.30 52.0 0.292
3.1 none 6 36.78 21.48 17.00 23.5 33.75 34.50 78.2

Визуальное представление данных относительно концентрации белка в образцах мочи представлены на Рисунке 4.4

Сравнение концентриции белка в образцах мочи до и после фильтрации, парные сравнения

Figure 4.4: Сравнение концентриции белка в образцах мочи до и после фильтрации, парные сравнения

Оценку количесвта белка, потерянного при фильрации облразцов на фильтре 300 кДа, проводили по формуле \(K_d=K_{native}-K_{300kDa}\), где \(K_{native}\) - исходная концентрация белка, \(K_{300kDa}\) - концентрация белка после фильтрации образца. Данные об изменении конценратции бекла в образцах мочи представлены в таблице

N Mean SD Min Q1 Median Q3 Max
BioChem_TotalProt_none 6 38.00 19.10 20.40 28.60 33.25 37.40 75.1
BioChem_TotalProt_filter300KDa 6 24.32 14.33 9.60 16.10 20.20 29.70 50.1
Protein_ProteOrange_none 6 37.60 20.91 17.43 26.30 33.67 36.70 77.8
Protein_ProteOrange_filter300KDa 6 25.36 14.86 10.16 15.00 22.95 28.48 52.6
Protein_Bradford_none 6 36.78 21.48 17.00 23.50 33.75 34.50 78.2
Protein_Bradford_filter300KDa 6 24.77 15.16 9.60 12.10 23.30 28.30 52.0
BioChem_TotalProt_Delta 6 13.68 5.97 7.70 10.80 12.10 14.40 25.0
Protein_ProteOrange_Delta 6 12.24 6.55 7.27 8.22 10.73 11.30 25.2
Protein_Bradford_Delta 6 12.02 7.27 5.90 7.40 10.60 11.40 26.2

4.4 Измерение концентрации уромодулина в образцах мочи

Измерение концентрации уромодлина проводили методом ИФА в образцах нативной мочи и после фильтрации 300кДа. Данные уровня уромодулина приведены в Таблице ??

N Mean SD Min Q1 Median Q3 Max
ELISA_UMOD_MEAN_none 6 6.43 2.62 2.74 5.83 5.94 7.34 10.78
ELISA_UMOD_MEAN_filter300KDa 6 0.69 0.15 0.58 0.63 0.64 0.67 0.99
ELISA_UMOD_MEAN_Delta 6 5.74 2.61 2.17 4.84 5.31 6.70 10.11
ELISA_UMOD_HDB_MEAN_none 6 12.27 6.15 4.71 9.38 11.02 14.44 23.04
ELISA_UMOD_HDB_MEAN_filter300KDa 6 0.71 0.22 0.52 0.53 0.64 0.83 1.10
ELISA_UMOD_HDB_MEAN_Delta 6 11.55 5.98 4.18 8.55 10.44 13.79 21.94

Парные сравнения потери белка измереннного в моче (биохимический анализатор, метод Бредфорда и флуоресцентный метод) и падение концентрации уромодулина в образцах мочи после фильтрации представлены на Рисунке 4.5

Изменение конценртации общего белка и уромодулина в моче, парные сравнения

Figure 4.5: Изменение конценртации общего белка и уромодулина в моче, парные сравнения

Для оценки динамики и оценки схожести измеренных показателей на Рисунке 4.6 приведены даннные регрессионного анализа и величина коэффициента корреляции по Пирсону.

Изменение конценртации общего белка и уромодулина в моче, парные сравнения

Figure 4.6: Изменение конценртации общего белка и уромодулина в моче, парные сравнения