Flujo de trabajo 16S

Preparar ambiente de trabajo

• Conectar al servidor

SSH -Y xibalba@148.247.195.49

• Ir a mi directorio o crear directorio con mkdir

cd Miriam

• Crear directorios Run16S y dentro de Run16S crear directorios Qiime2 y Raw

• Jalar los archivos .fastq.gz al directorio de Raw (En win SCP)

Análisis de amplicones

• Activar Qiime2

conda activate qiime2-2022.2

• Importar datos de secuenciación (en directorio Run)

Paired end:

qiime tools import –type ‘SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]’ –input-path Raw –input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt –output-path ../Run16S/Qiime2/Run18.qza

Single end (en Raw deben de ir solo los archivos R1):

qiime tools import –type ‘SampleData[SingleEndSequencesWithQuality]’ –input-path Raw –input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt –output-path ../Run16S/Qiime2/Run9.qza

• Hacer archivo para visualizar (en directorio Qiime2)

qiime demux summarize –i-data Run18.qza –o-visualization Run18.qzv

• Checar calidad Qscore

qiime tools view Run18.qzv

o ingresar a link e ingresar el archivo .qzv

• Trimming (remover índices en directorio Qiime2)

nohup qiime dada2 denoise-paired –i-demultiplexed-seqs Run18.qza –p-trim-left-f 30 –p-trim-left-r 30 –p-trunc-len-f 240 –p-trunc-len-r 240 –p-n-threads 10 –output-dir dada_Run1 –verbose &

Para single end:

nohup qiime dada2 denoise-single –i-demultiplexed-seqs Run18.qza –p-trim-left 30 –p-trunc-len 240 –p-n-threads 10 –output-dir dada_Run1 –verbose &

NOTA: Después de trimear, tienes que tener en tu carpeta dada_Run28 denoising_stats.qza, representative_sequences.qza y table.qza

• Exportar datos de porcentajes de secuencias a carpeta stats

qiime tools export –input-path denoising_stats.qza –output-path stats

• Visualizar en carpeta stats

more stats.tsv

Asignación taxonómica

NOTA: Se utiliza la base de datos de Silva

• Ir a carpeta dada

• Clasificación taxonómica de las secuencias

nohup qiime feature-classifier classify-consensus-vsearch –i-query representative_sequences.qza –i-reference-reads /home/xibalba/Silva/silva-138-99-seqs.qza –i-reference-taxonomy /home/xibalba/Silva/silva-138-99-tax.qza –p-threads 10 –output-dir taxa_Run1 –verbose &

• Alineación de secuencias y construcción del árbol filogenético

nohup qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree –i-sequences representative_sequences.qza –p-n-threads 4 –output-dir aln_tree

Exportación de datos

• Exportar archivos de salida

qiime tools export –input-path table.qza –output-path exported-feature-table

Para este momento en dada se genera la carpets aln_tree, ir a esa carpeta

cd aln_tree

• Exportación de archivo

qiime tools export –input-path rooted_tree.qza –output-path tree

• Volver a carpeta dada y ahí ejecutar

mv exported-feature-table/feature-table.biom .

• Ir a carpeta taxa_Run

qiime tools export –input-path classification.qza –output-path taxonomy

• Mover archivo a taxa

mv taxonomy/taxonomy.tsv ../

• Volver a carpeta dada y convertir archivo a texto. Para eso verificar tener el archivo .tsv

biom convert -i feature-table.biom -o table.from_biom.txt –to-tsv

• Abrir archivo taxonomy.tsv con nano y cambiar termino consensus por confidence

nano taxonomy.tsv

Ctrl+O y Enter para guardar Ctrl+x para salir

• Visualización de tabla de características

qiime feature-table summarize –i-table table.qza –o-visualization table.qzv

• Generar árbol filogenético a partir de secuencias representativas

qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree
–i-sequences representative_sequences.qza
–p-n-threads 22 –output-dir alg_tree

• Obtener archivo .biom

qiime tools export –input-path /home/xibalba/Miriam/Run16S/Qiime2/dada_Run1/table.qza
–output-path /home/xibalba/Miriam/Run16S/Qiime2/dada_Run1/Rfiles

• Obtener archivo .nwk

qiime tools export –input-path /home/xibalba/Miriam/Run16S/Qiime2/dada_Run1/alg_tree/rooted_tree.qza
–output-path /home/xibalba/Miriam/Run16S/Qiime2/dada_Run1/Rfiles

• Obtener archivo .tsv

qiime tools export –input-path /home/xibalba/Miriam/Run16S/Qiime2/dada_Run1/taxa_Run16S/classification.qza
–output-path /home/xibalba/Miriam/Run16S/Qiime2/dada_Run1/Rfiles

• Obtener archivo TableWithTaxa.biom

biom convert -i feature-table.biom -o table.from_biom.txt –to-tsv

biom add-metadata -i feature-table.biom -o TableWithTaxa.biom –observation-metadata-fp taxonomy.tsv –observation-header OTUID,taxonomy –sc-separated taxonomy

biom convert -i TableWithTaxa.biom -o FinalTable.txt –to-tsv –header-key taxonomy

• Unir todos los archivos de Rfiles, para eso ir a carpeta de Rfiles

biom add-metadata -i feature-table.biom -o table-with-taxonomy.biom
–observation-metadata-fp taxonomy.tsv –observation-header OTUID,taxonomy
–sc-separated taxonomy

NOTA: Archivos para descargar y trabajar en R (deben estar en Rfiles) feature-table.biom FinalTable.txt TableWithTaxa.biom taxonomy.tsv tree.nwk

Librerías para descargar en R: Phyloseq metagMisc Vegan Ggplot2 MicrobiotaProcess