Uso de didesoxinucleótidos (ddNTP)

Aprox. 100 pb

Técnica Manual de Sanger

~ 500 pb

Técnica automatizada de Sanger

Illumina: MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq

PacBio: Sequel

Oxford Nanopore Technology: MinION

DNA polimerasa

1. Toma una muestra de ADN, que incluya muchas copias, la fragmenta (plantillas)

2. Adjunta las plantillas a la superficie

3. Hace muchas copias de cada template (cluster de clones)

Ilumina

4) Por cada grupo individual se leerá una señal florescente. Cada nucleotido tendrá un color. Cuando un nucleotido es añadido al cluster, el color correspondiente se ilumina y es emitido. Capturando una imagen mientras sucede.

Ilumina

5)Por cada cluster se genera señales luminicas, dando una serie de nucleotidos

Ilumina

Los errores pueden ocurrir al momento de saltarse un nucleotido o insertar hasta dos o más

Los errores son más comunes en ciclos más avanzados de la secuenciación

Ilumina

Ilumina puede secuenciar ambos lados del fragmento a secuenciar, conocidos como read pairs (lecturas en pares). Estos ayudan a resolver problemas de repetición

Ilumina

Ventajas:

3,8 millones de paired read

10.000 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||## Introducción a la secuenciación de próxima generación | ¿cómo funcionan los secuenciadores? Un secuenciador típico mide un fragmento de ADN de una sola cadena y a partir de ese fragmento produce una “lectura de secuenciación” de cierta longitud

XXXXGGGGTTTTYYYY

Problema “read-through”, en la que la secuenciación es más larga que el fragmento

Una Molecula de ADN y una polimerasa en cada pozo

Sin limite por fragmentación

PacBio

Illumina: MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq

• Illumina: 0.1% rango de error (1/1000)

• PacBio: 10% rango de error (1/10)

• MinION: 20% rango de error (1/5)

2)La adición de secuencias adaptadoras (oligos) específicas de la tecnología crea “bibliotecas listas para la secuenciación”.

3)La amplificación controlada (PCR) es necesaria con la mayoría de los métodos de preparación

4)La detección de la síntesis se realiza mediante métodos luminosos (Illumina, PacBio) o no luminosos (Oxford Nanopore, Ion). Medición (cuantificación) por: qPCR o fluorometría

5)Normalización de datos y validación. Posteriormente, para generar la secuencia real es necesario el posprocesamiento de los datos “en bruto”.

La forma de identificar las similitudes y diferencias de secuencias evolutivas se denomina alineamiento de secuencias.

En palabras sencillas, la comparación de secuencias se denomina alineamiento

Cuando las secuencias comparten suficiente parecido, se dice que son homólogas y este fenómeno se denomina homología.

Hasta el 40 % de Identidad es una Zona segura

Entre el 20 % y el 40 % Zona crepuscular

Menos del 20 % Zona de medianoche

Las secuencias homólogas proceden de un ancestro común

En las proteínas, los conceptos de identidad y similitud son diferentes.

En el ADN, los conceptos de identidad y similitud son los mismos.

1. Pairwise Sequence Alignment (por pares)

2. Multiple Sequence Alignment (multiple)

1- Alineación global de secuencias por pares: La alineación global de secuencias se realiza entre secuencias relacionadas

2-Alineación local de secuencias por pares: La alineación local de secuencias por pares se realiza entre secuencias no relacionadas.

1- Observe la longitud de las secuencias.

2- Las secuencias relacionadas tienen una longitud comparable

1. Dot Matrix (Matriz de Puntos): comparación de Secuencias de tipo Cualitativo

2. Programación Dinámica: realiza la comparación de secuencias de forma cuantitativa.

3. Método de palabras: realiza la comparación de secuencias de forma cuantitativa, pero se utiliza sobre todo en la búsqueda de bases de datos.

Proporciona un análisis visual de la comparación de secuencias

Nos informa sobre secuencias repetidas

Al mismo tiempo nos informa sobre el alineamiento local y global

Es un tipo cualitativo de comparación de secuencias

No representa toda la historia evolutiva

Emboss: dotmatcher

También puede haber muchas otras formas

La diagonal no debe comprometer la puntuación

Los huecos se insertan en la alineación cuando se rompe la diagonal, esto se conoce como penalización de hueco

Cuando se rompe la diagonal y se asigna una penalización, esto se conoce como apertura de huecos

Cuando se reanuda la línea diagonal, esto se conoce como cierre de huecos

Cada hueco representa una supresión o inserción

Se utilizan diferentes matrices de puntuación para las secuencias de proteínas y nucleótidos, como BLOSUM y PAM.

EMBL-EBI

Comparará su secuencia de consulta con millones de secuencias presentes en la base de datos en pocos minutos.

Algoritmo heurístico Baja sensibilidad y baja especificidad, poco tiempo

Basado en el Algoritmo de Palabras Tenemos una herramienta que se conoce como Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico (BLAST)

Estadisticos importantes:

Query_coverage

E-Value

Percentage identity

El número de residuos de la secuencia de consulta que se alinea correctamente con la secuencia de la base de datos se conoce como cobertura de la consulta.

Uno de los estadisticos más importantes de BLAST

                      E = m x n x P

m = Número total de residuos presentes en la base de datos en el momento de la búsqueda

n = Número de residuos presentes en la consulta buscada en la base de datos

P = Probabilidad de HSP formado durante la alineación

              E = 10^10 x 100 x 10-18   =  10-6

Cuántas coincidencias exactas se encuentran durante la alineación

En el caso de las proteínas, este valor es importante

La cobertura debe ser alta

El E-value debe ser bajo

La Identidad máxima debe ser alta

nota: solo preocuparse por el e-Value puede ser fatal

1.Nucleotide BLAST

BLAST puede ser usado desde la terminal de comandos con la herramienta blast de conda o desde su página web.

Pasos para usar blast

1. Tener una secuencia de consulta

2. Tener una base de datos o en su caso crearla

3. Realizar el alineamiento

1. Descarguemos secuencias de consulta con el software entrez.

En este ejemplo vamos a obtener genes de resistencia a antibioticos de salmonella

esearch -db nucleotide -query "antibiotic resistance" | efilter -organism salmonella | efetch -format fasta > samonella.fasta

1. Descarguemos la base de datos.

Usaremos el genoma en formato fasta de salmonella bongori https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/

wget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/439/255/GCF_000439255.1_ASM43925v1/GCF_000439255.1_ASM43925v1_genomic.fna.gz

1. Creamos la base de datos

makeblastdb -in secuencias.fasta -dbtype nucl -out mi_base_de_datos

1. Alineamos las secuencias con la base de datos que creamos

blastn -db salmonella -query salmonella.fasta  -out resultados.txt

Pueden ser Globales y locales

Recaen en ser algoritmos heuristicos

Globales:

1.Alineación progresiva de secuencias

2.Alineación iterativa de secuencias

Locales:

1.Método por bloques

Cuanto mayor sea la puntuación, mayor será la distancia de la secuencia, lo que significa que es más divergente.

1. T-Coffe

2. Clustalw

3. Muscle

4.Diamond

Diamond utiliza un algoritmo heurístico para generar alineamientos de alta calidad entre secuencias, lo que lo hace más preciso que BLAST en algunos casos.

Diamond tiene la capacidad de generar resultados en diferentes formatos de salida, incluyendo formatos compatibles con BLAST, lo que facilita la comparación y el análisis de resultados entre diferentes herramientas.

conda install -c bioconda diamond
conda install -c "bioconda/label/cf201901" diamond

Para hacer un alineamiento con diamond es necesario

1. Instalar diamond

2. Descargar la base de datos

3. Preprocesar la base de datos con diamond makedb

4. Ejecutar diamond

conda install -c bioconda diamond
conda install -c "bioconda/label/cf201901" diamond

Estas puedes descargarse desde uniprot https://www.uniprot.org/downloads o desde NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/

Procesa la base de datos

diamond makedb --in nombre_de_la_base_de_datos.fasta --db 
nombre_de_la_base_de_datos

Para hacer un blastx

diamond blastx -d nombre_de_la_base_de_datos -q secuencias.fasta -o 
resultados.txt

Para hacer un blastp:

diamond blastp -d nombre_de_la_base_de_datos -q secuencias.fasta -o 
resultados.txt

Para hacer un tblastn

diamond blastn -d nombre_de_la_base_de_datos -q secuencias.fasta -o 
resultados.txt

Para hacer un blastn

diamond blastn -d nombre_de_la_base_de_datos -q secuencias.fasta -o 
resultados.txt

Descargaremos la base de datos uniprot

https://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/complete/uniprot_sprot.fasta.gz

Tambíen secuencias en formato fasta del organismo, usando la herramientas entrez

esearch -db protein -query "catalase" | 
efilter -organism Arabidopsis thailana | 
efetch -format fasta > Arabidopsis_protein.fasta

Creamos la base de datos que será el genoma del organismo

diamond makedb --in uniprot_sprot.fasta --db uniprot  

Hacemos el bast, en este caso un blastx

diamond blastp -d uniprot -q Arabidopsis_protein.fasta -o resultados.txt

Con el resultado que acabamos de obtener de blastp, haremos un alineamiento de secuencias con muscle:

1. Instalemos muscle

conda install -c bioconda muscle
conda install -c "bioconda/label/cf201901" muscle

1. Hagamos el alineamiento

muscle -in resultados.txt -out alineamiento.fasta

La bioinformática evolutiva es una rama de la bioinformática que se enfoca en el análisis de datos moleculares para entender mejor la evolución biológica.

¿Qué es la evolución?

Desde el punto de vista biológico, el desarrollo de una nueva característica biológica a partir de una preexistente mediante el proceso de selección natural y modificación se conoce como evolución.

Bases

1. La evolución molecular es el resultado de la acumulación de mutaciones en los genes en forma de sustitución, inserción/deleción, recombinación y conversión génica

2. Esto genera variantes: Polimorfismos

3. Hay dos fuerzas evolutivas: a) La selección natural y b) La deriva génica

1. La evolución es determinista y estocastica

El término homología se refiere a la relación evolutiva entre rasgos de diversos organismos.

Existen diferentes tipos de homología:

1. ortólogos

2. Paralogos

3. Xenologos

Los genes ortólogos y paralogos deben ser para el análisis filogenético con el fin de comprender la especiación y la duplicación

Los taxones existentes están representados por las hojas terminales o nodos y se conocen comúnmente como unidad taxonómica operativa (UTO).

Los nodos internos se conocen como unidades taxonómicas (HTU).

Un árbol filogenético sin raíces sólo proporciona detalles sobre la topología y la longitud de las ramas. Sin embargo, carece de información vital sobre la historia evolutiva de las secuencias estudiadas

1. Elegir el marcador molecular

2. Realizar el alineamiento

3. Seleccionar el modelo evolutivo

4. Construcción del árbol

5. Evaluación de la correción del árbol

1.Marcador molecular

ADN o Proteinas

¿Cúando usar uno u otro?

2.Realizar el alineamiento (MSA)

3.Seleccionar el modelo evolutivo (Distancias geneticas):

• La tasa de sustitución es directamente proporcional a la distancia evolutiva

• El número de sustituciones observado puede ser distinto del real

• Esto puede oscurecer nuestra capacidad de observar la verdadera distancia evolutiva. Esto se conoce como homoplasia

Existen dos modelos evolutivos:

1. Jukes-Cantor Model

2. Kimura Model

El número de sustituciones ocurridas en las secuencias se estiman utilizando un modelo evolutivo específico que mejor se ajuste a los datos

*No se basa en un modelo explícito de evolución.

*Este método busca un árbol o una colección de un árbol asumiendo un número mínimo de cambios genéticos desde un ancestro común a sus descendientes.

*La máxima verosimilitud busca el mejor árbol entre un conjunto de hipótesis que compiten entre sí.

conda install -c bioconda clustalo
conda install -c "bioconda/label/cf201901" clustalo

## Creamos un archivo de alineamiento 
##Tenga en cuenta que si las secuencias son de ADN, debe especificar --seqtype=dna 
### en lugar de --seqtype=protein

clustalo -i archivo.fasta --outfmt=clustal --seqtype=protein -o alineamiento.aln

## Creamos el arbol filogenetico con el alineamiento 
clustalo -i alineamiento.aln --guidetree-out=arbol.dnd --force

PhyML es un software de inferencia filogenética que utiliza métodos de máxima verosimilitud (ML) para construir árboles filogenéticos a partir de MSA. Es rápido, fácil de usar y puede manejar grandes conjuntos de datos.

Instalando phyml:

conda install -c bioconda phyml
conda install -c "bioconda/label/cf201901" phyml

Este comando ejecuta PhyML en el archivo de secuencia especificado (-i), especifica que las secuencias son nucleótidos (-d nucleotide), y usa el modelo de sustitución GTR (-m GTR). Puede elegir otros modelos de sustitución según sus necesidades.

phyml -i archivo_de_secuencia.fasta -d nucleotide -m JC69

Una vez que PhyML haya terminado de ejecutarse, se generará un archivo de salida con el árbol filogenético. Puede abrir este archivo con un visor de árboles filogenéticos, como FigTree http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ o iTool https://itol.embl.de/, para visualizar el árbol.

Problema:

Existen algunas familias de genes que se sabe que están relacionados con el cáncer tanto en perros como en humanos. El cáncer es una enfermedad compleja y multifactorial que puede ser causada por una combinación de factores genéticos y ambientales. Los estudios han demostrado que algunos tipos de cáncer en perros tienen una base genética similar a los humanos, lo que sugiere que las mutaciones en ciertos genes pueden contribuir al desarrollo del cáncer en ambas especies.

1. Realiza una busqueda en pubmed y averigua el nombre de algunas familias de genes asociados al cáncer de ambas especies

2. Descarga en formato fasta todas las secuencias relacionadas a esa familia de genes.

3. Realiza un alineamiento multiple de secuencias con las secuencias descargadas (Incluye especies relacionadas o diferentes razas de perros)

4. Crea un árbol filogenetico con organismos que compartan esa familia de genes (incluyendo el del perro y humano)

5. Interpreta como a evolucionado esa familia de genes.

Este ejercicio se entregará el miércoles 5 de abril. Dentro del documento se deberá responder ciertas preguntas clave.